טכניקת FISH במחקר הציטוגני

תקציר העבודה:

טכניקת FISH במחקר הציטוגני

תוכן עניינים hc1059
מבוא
התפתחות הטכניקה ויישומיה
סיכום
ביבליוגרפיה

תמצית
FISH) Fluorescence In Situ Hybridization) מאפשרת לזהות רצפי DNA או RNA
ספציפיים ברמת התא היחיד. שיטה זו הפכה להיות כלי חשוב למחקר כרומוזומלי,
ביולוגיה תאית, ודיאגנוזה ציטוגנטית. במשך השנים האחרונות השתפרה מאוד
רגישות השיטה. ניתן כיום לאתר ולזהות רצפים בגודל של החל ממספר Kb ועד
שרטוט כרומוזום שלם, תוך שימוש בגלאי (DNA (Probe מורכבים שנבנו
מכרומוזומים ממויינים. מלבד השיפור ברגישות השיטה, פותחו פרוטוקולים ל-
Multi Colour FISH עבור זיהוי סימולטני של כרומוזומים שונים ואיזורי
כרומוזומים. בכל העולם מיישמים ציטוגנטיקאים פרוטוקולים של FISH שנעשה
בהם שימוש רב במעבדותיהם. יותר ויותר הופכים פרוטוקולים אלה לחשובים
לאפליקציות קליניות.
טכניקות FISH) Fluorescence In Situ Hybridization) הפכו לכלי חשוב לא רק
במחקר הציטוגנטי אלא גם בדיאגנוזות כרומוזומליות קליניות רוטיניות.
במאמר זה אנסה לסקור חלק זעום אך מייצג מתוך מאות המאמרים (ויתכן שאף
אלפים) שנכתבו על שיטה זו, ואדון בפניה ויישומיה הרבים במחקר הביולוגי
והרפואי.

מקורות:

1002
טכניקת FISH במחקר הציטוגני
תוכן עניינים
מבוא
התפתחות הטכניקה ויישומיה
סיכום
ביבליוגרפיה
מבוא
טכניקות Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) הפכו לכלי חשוב לא רק במחקר הציטוגנטי אלא גם בדיאגנוזות כרומוזומליות קליניות רוטיניות.
במאמר זה אנסה לסקור חלק זעום אך מייצג מתוך מאות המאמרים (ויתכן שאף אלפים) שנכתבו על שיטה זו, ואדון בפניה וישומיה הרבים במחקר הביולוגי והרפואי.
התפתחות טכניקת FISH ויישומיה
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) מאפשרת לזהות רצפי DNA או RNA ספציפיים ברמת התא היחיד. שיטה זו הפכה להיות כלי חשוב למחקר כרומוזומלי, ביולוגיה תאית, ודיאגנוזה ציטוגנטית. במשך השנים האחרונות השתפרה מאוד רגישות השיטה. ניתן כיום לאתר ולזהות רצפים בגודל של החל ממספר Kb ועד שרטוט כרומוזום שלם,
תוך שימוש בגלאי (Probe) DNA מורכבים שנבנו מכרומוזומים ממויינים. מלבד השיפור ברגישות השיטה, פותחו פרוטוקולים ל-Multi Colour FISH עבור זיהוי סימולטני של כרומוזומים שונים ואיזורי כרומוזומים. בכל העולם מיישמים ציטוגנטיקאים פרוטוקולים של FISH שנעשה בהם שימוש רב במעבדותיהם. יותר ויותר הופכים פרוטוקולים
אלה לחשובים לאפליקציות קליניות.
מולקולות פלורסנטיות סופגות אור באורכי גל מסויימים ופולטות אותו באורכי גל אחרים, בדרך כלל ארוכים יותר. אם תרכובת פלורסנטית מוארת באורכי גל הקליטה שלה ולאחר מכן נצפית דרך פילטר המאפשר רק לאור באורך הגל הנפלט לעבור, נראית התרכובת כזוהרת כנגד רקע כהה. משום שהרקע כהה, אפילו כמויות קטנות של צבעי פלורסנט
זוהרים יכולים להיות מזוהים. כמות דומה של מולקולות של צביעה רגילה אחרת יהיו בלתי נראות.
הצבעים הפלורסנטיים בהם נעשה שימוש מזוהים באמצעות מיקרוסקופ פלרסנטי. מיקרוסקופ זה דומה למיקרוסקופ אור רגיל, אלא שהאור המאיר בו, ממקור חזק מאוד, עובר דרך שני מערכים של פילטרים - האחד לסינון האור לפני שהוא מגיע לדוגמית והשני לסינון האור הנפלט מן הדוגמית. הפילטר הראשון נבחר כך שיעביר רק את אורכי הגל
המעוררים את הצבע הפלורסנטי המסויים, בעוד שהפילטר השני חוסם את האור הזה ומעביר רק את אורכי הגל הנפלטים מן הצבע הפלורסנטי.
במיקרוסקופ הפלורסנטי נעשה שימוש רב בזיהוי חלבונים ספציפייםאו מולקולות אחרות בתאים וברקמות. שני צבעים פלורסנטיים בהם נעשה שימוש רב הם פלורסין, הפולט אור פלורסנטי ירוק רב עוצמה כאשר הוא מעורר באור כחולף ורודאמין, הפולט אור אדום עמוק כשהוא מעורר באור ירוק-צהוב.
חומצות הגרעין ממוקמות באופן מדוייק בתאים ורקמות, ואינפורמציה פוטנציאלית עצומה אובדת כאשר מולקולות אלה ממוצות בהומוגנציה. מסיבה זו, פותחו שיטות בהן נעשה שימוש בגלאים העשויים מחומצות גרעין , באופן דומה לשימוש בנוגדנים לסימון ואיתור רצפים ספציפיים של חומצות גרעין in situ. פרוצדורה זו נקראת in situ
hybridization. שיטה זו יכולה להיות מיושמת הן עבור DNA בכרומוזומים והן עבור RNA בתאים. גלאי חומצות גרעין מסומנים יכולים לעבור היברידיזציה (טכניקת מיון בה מקור של DNA דו-גדילי עובר דנטורציה לשני גדילים, ואם מדובר ב-RNA הוא חד-גדילי בדרך כלל מלכתחילה, תוך איפשור אנילציה מחודשת עם דוגמה דומה של DNA
ממקור אחר, או RNA חד-גדילי - mRNA) לכרומוזומים שעברו דנטורציה. איזורי הכרומוזומים הקושרים אליהם את הגלאים במשך ההיברידיזציה, נראים מאוחר יותר. במקור פותחה שיטה זו לשימוש בגלאי DNA רדיואקטיביים מאוד, שזוהו על ידי אוטורדיוגראפי. אולם, הסידור המרחבי של טכניקה זו יכול להשתפר מאוד באמצעות סימון הגלאים
באופן כימי ולא רדיואטקטיבי. למטרה זו מסונתזים הגלאים עם נוקליאוטידים מיוחדים המכילים שרשרת צדדית שעברה מודיפיקציה פלורסנטית, והגלאים שעברו היברידיזציה מזוהים על ידי מיקרוסקופ פלורסנטי.
רצפי DNA ספציפיים בהכנות מיקרוסקופיות של כרומוזומים, תאים או רקמות, היו מזוהים שנים רבות על ידי היברידיזציה של RNA קומפלמנטרי מסומן ב- או (cRNA) ל-DNA in situ, שלאחריה מיושם פרוטוקול אוטורדיוגראפי. טכניקה זו מיושמת פעמים רבות, כאמור, בביולוגיה של התא ובמחקרים גנטיים, אך התוצאות היו לא חד-משמעיות
באוטורדיוגראפי, והיה גם צורך בזמן חשיפה ארוך יחסית. על מנת לעקוף את החסרונות הללו השתמשו Rudkin Stollar במיקרוסקופייה פלורסנטית בכדי לזהות RNA היברידי. ההיברידים הוגבו in situ עם נוגדן כנגד היבריד RNA-DNA, והנוגדנים הקשורים נראו במיקרוסקופ פלורסנטי על ידי אימונופלורסנציה עקיפה. Bauman et al תארו
בשנת 1980 שיטה אלטרנטיבית לזיהוי של היברידיזציה in situ על ידי מיקרוסקופ פלורסנטי המבוססת על הקשירה הקוולנטית של מולקולה פלורסנטית ל-RNA שבשימוש. הם הראו כי ניתן להשתמש בשיטה זו על מנת לראות DNA קינטופלאסטי (kDNA - ה-DNA המיטוכונדריאלי של טריפנוזום) בטריפנוזום Crithidia luciliae, DNA של אדנווירוס-
5 (Ad-5) בתרבית תאים אנושית ואת הגנים של RNA 5S ריבוזומלי (rRNA) בכרומוזומי פוליטן של בלוטת הרוק של Drosophila hydei.
סימון ה- RNA נעשה עם נגזרת הידראזין של TRITC (tetramethyl rhodamine isothicyanate), אחד מסוגי האיזוטיציאנט בהם נעשה שימוש באימונופלרסנציה. הטיאוסמיקרבזיד הגיב עם הדיאלדהיד הנוצר בקצה 3' של ה- RNA על ידי חימצון מחזורי. בדרך זו מולקולת הרודאמין נקשרת ל- RNA דרך נגזרת מורפולין.
על מנת ללמוד את תכונות ה-RNA שסומן ברודאמין, השתמשו החוקרים במערכת מודל של טיפות אגרוז ו-cRNA המסומן ב- שסונתז in vitro עם kDNA או עם Ad-5 DNA כתבנית. ניתן לזהות היברידיזציה של RNA במערכת זו הן על ידי ספירת הפלורסנציה והן על ידי מיקרוסקופיה פלורסנטית כמותית.
בניסוי הראשון עברו cRNAs היברידיזציה לכמויות בנות מיקרוליטרים של טיפות ספארוז אליהן נקשרו קוולנטית kDNA או Ad-5 DNA שעברו דנטורציה. תוצאות הניסוי הראו כי הפלורוכרום בקצה 3' אינו מפריע להיברידיזציה של ה-RNA, במיוחד לאחר שסולק כל הפלורוכרום החופשי. היה צורך לבצע את ההיברידיזציה בטמפרטורה נמוכה יחסית
של ולמשך 40 שעות על מנת להימנע משבירת הקשרים בין הפלורוכרום לבין ה-RNA.
הניסוי השני של Bauman וחבריו כלל היברידיזציה in situ של RNA מסומן בפלורוכרום. לאחר ההיברידיזציה עם cRNA המסומן ברודאמין נצבעו הפרפאראטים ב-4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) שיש לו תכונות של פלורסנציה כחולה לאחר קשירתו ל-DNA.לאחר מכן צולמו ה-DAPI הכחול והרודאמין האדום באותם שדות. צילומים אלו הראו
כי ההיברידיזציה של ה-cRNA הקינטופלאסטי המסומן ברודאמין עם הפרפאראטים השייכים ל-Crithidia הובילה אך ורק לפלורסנציה אדומה בקינטופלאסט מבלי שנצפתה כל פלורסנציה בגרעין, הנראה בבירור בצילומי ה-DAPI. במקביל הראו תאי KB שהודבקו באדנווירוס ועברו היברידיזציה עם ה-cRNA של Ad-5 המסומן ברודאמין, פלורסנציה רק
בגרעין, בעוד שתאים שלא הודבקו בנגיף לא הראו פלורסנציה כלל. ההסתכלות האלטרנטיבית בין ה-DAPI הכחול לבין הרודאמין האדום התבצעה באמצעות שינוי אורכי הגל.
ניתן לכמת פלורסנציה מקומית באיזור ספציפי באמצעות מיקרופוטומטר ובכך לאמוד את כמות ה-RNA ההיברידי. בשיטה זו היה ניתן לזהות כמויות מינימליות של מולקולות רודאמין למיקורמטר מרובע כנגד רקע שחור. היתרון המשמעותי שנצפה בהיברידיזציה in situ על פני אוטורדיוגראפי הוא כוח הסידור המרחבי של השיטה. יתרון נוסף
הוא כי התוצאות של ההיברידיזציה in situ יכולות היו להיות מוכנות תוך יום אחד. הפרפאראטים עצמם היו יציבים למשך מספר שבועות. כמו כן, כימות ה-RNA ההיברידי קל לביצוע באמצעות המיקרופוטומטר.
בסיום מאמרם כותבים Bauman וחבריו כי "הטכניקה המתוארת יכולה לאפשר זיהוי מהיר באמצעים ציטומטריים של סדרות DNA ספציפיות בתרחיף תאים, כגון פרופורציית התאים שהודבקו על ידי נגיף. יישום זה, שיכול לספק מידע על הפלורסנציה של מספר גדול של תאים, שאינו יכול להיות מושג בשיטות אוטורדיוגראפיות, נמצא תחת מחקר.
זיהוי הדבקת וירוס מסוייםבתרביות רקמה באמצעות היברידיזציה in situ מיושם בשיטת האוטורדיוגראפיה. השימוש ב-RNA המסומן פלורסנטית למטרה זו עשוי, משום מהירות השיטה והסימון הלא-רדיואקטיבי, לכניס את ההיברידיזציה in situ לשימוש יומיומי בדיאגנוזות ציטופאטולוגיות".
התקדמות אדירה בציטוגנטיקה התרחשה כשפותחו שיטות חדשות להבדיל בין סוגי כרומוזומים. פרוצדורות צביעת הפסים (Banding) מאפשרות זיהוי של של כרומוזימים מסויימים בתוך מינים וזנים, ופרוצדורת G-11 מבדילה בין כרומוזומים של אדם ומכרסם. אולם טכניקות אלה כרוכות בפרישה המטאפאזית והן מראות רק על הבדלים דקים בין
הכרומוזומים, כך שהמיון דורש עבודה רבה ויכול להתבצע רק על ידי מומחים. הניתוח יכול להיות פשוט יותר באמצעות פיתוח שיטת צביעת כרומוזומים חד-משמעית יותר, במיוחד אם ניתן ליישמה בתאים הנמצאים בשלב האינטרפאזה. בשנת 1986 תארו Pinkel וחבריו את ההתקדמות שאיפשרה פיתוח שיטה זו: 1. פיתוח היברידיזציה in situ
לזיהוי רגיש של רצפי חומצות גרעין ספציפיות בתאים בשלב המטאפאזה או האינטרפאזה. גלאים שסומנו רדיואקטיבית מזוהים בשיטות אוטורדיוגראפיות, וגלאים שעברו מודיפיקציה כימית מזוהים באמצעות פעילות אינזימתית או פלורסנציה. 2. התגלית כי כרומוזומים אינדיבידואליים מוגבלים למקום מסויים בשלב האינטרפאזה. 3. זיהוי
הומולוגיות של רצפי חומצות גרעין לאיזורים נרחבים בכרומוזום. Pinkel וחבריו הדגימו במחקרם את השימוש בהיברידזציה in situ וזיהוי פלורסנטי, דהיינו בהיברידיזציה פלורסנטית, עבור 1. סימון כרומוזומים אנושיים בשלב המטאפאזה והאינטרפאזה בתאים היברידיים של אדם-אוגר. 2. איתור טראנסלוקציות בין המינים. 3. סימון
כרומוזומים אנושיים ספציפיים בתאים אנושייםבשלבי המטאפאזה והאינטרפאזה. 4. כימות מספר רצפי ה-DNA הנחקרים. כמו כן הראו החוקרים כי היברידיזציה פלורסנטית המציגה ניגוד (קונטראסט) גבוה אפשרית, כאשר נעשה שימוש בגלאים בסדר גודל של 50 Kb.
נקודת המוצא של החוקרים היתה כי היברידיזציה פלורסנטית תלויה מאוד בנגישות רצפי ה-DNA הספציפיים לגלאים וברמה בה ניתן לדכא קשירת גלאים לא ספציפיים. הנגישות לגלאי תלויה בטיב ההכנה והאיחסון. ההיברידיזציה הפלורסנטית מציגה תוצאות טובות ביותר כאשר הפרפאראטים טריים, אך הכרומוזומים נראים מוכיים (מן המילה מוך
- פלומה) לאחר ההיברידיזציה. עם העלאת זמן האיחסון באויר הפתוח נותרים הכרומוזומים קומפקטיים ועוצמת ההיברידיזציה יורדת. הזמן האידאלי נמצא כשבוע. נמצא גם כי עטיפת ה-DNA מסביב לכל כרומוזום נגישה יותר לריאגנט ההיברידיזציה מאשר ה-DNA המרוכז בתוך הכרומוזום. כמו כן, הורדת הקשירה הלא-ספציפית מעלה את הרגישות
באמצעות התרת עלייה באמפליפיקציה תוך שימוש בחומרים כמו אנטיווידין הקשור לביוטין (אמפליפיקציה של לפחות פי שניים).
החוקרים מסכמים וטוענים כי צביעה פלורסנטית של כרומוזומים תוך שימוש בגלאים הספציפיים לרצפי חומצות הגרעין שבכרומוזום, מביאים לניתוח ציטוגנטי בו חשובים המהירות, הסימון בניגוד גבוה והכימות. היישומים האפשריים כוללים זיהוי של שינוי ספציפי במספר הכרומוזומים בתאים בשלב המטאפאזה והאינטרפאזה, כימות תדירות
הטראנסלוקציות הכרומוזומליות כאמדן לנזק גנטי וזיהוי פגיעות כרומוזומליות חשובות דיאגנוסטיות או פרוגנוסטיות.
היברידיזציות in situ מהוות שיטה רבת-חשיבות לקביעת מיקומם של רצפים ספציפיים של חומצות גרעין בכרומוזומים או בגרעין בשלב האינטרפאזה. הראשונים לפתח שיטה זו היו Gall Pardue בשנת 1969, שהשתמשו בגלאים רדיואקטיביים להיברידיזציה עם רצפים חוזרניים מאוד של כרומוזומים עכבריים בשלב המטאפאזה וכרומוזומי פוליטן
של דרוזופוליה, ואז איתרו את הגלאים באמצעות אוטוראדיוגראפיה. במקביל ובאופן בלתי תלוי פיתחו John וחבריו טכניקה זו לזיהוי RNA-DNA היברידיים בתאי Hela. למרות שהיברידיזציות in situ עם גלאים רדיואקטיביים היא רגישה מאוד ותוצאותיה מוצלחות למדי מבחינת זיהוי גנים בעלי עותק יחיד בכרומוזומים אנושיים, יש לגישה
זו מספר חסרונות, כולל רעש רקע גבוה, זמן עיבוד ארוך, ובעיות טכניות רבות.
במשך העשור האחרון פותחו מספר שיטות למודיפיקציות גלאים לא רדיואקטיביים לחומצות גרעין. לשיטות אלה יש יתרונות ביחס לשיטות הרדיואקטיביות מבחינת בטיחות, הפרדה מרחבית גבוהה, ורגישות טובה. בנוסף, ניתן היה לראות מטרות שונות באופן סימולטאני בדגימה אחת.
למרות שהשימוש בהיברידיזציה פלורסנטית in situ הולך ועולה בציטוגנטיקה, והשיטה הפכה לכלי קונבנציונאלי בניתוח כרומוזומאלי של איאוקריוטים עילאיים, מעטים יחסית המאמרים העוסקים בישומה בפטריות או שמרים. Shuxian וחבריו ניסו בשנת 1993 לקבוע שיטה לזיהוי גנים פטרייתים בעלי עותק אחד על ידי היברידיזציה in situ.
גלאים של DNA סומנו עם ביוטין או עם נוקליאוטידים המסומנים בדיגוקסיגנין, ועברו היברידיזציה לספורדיה הפלואידית. ה-DNA המסומן זוהה באמצעות הדמיה אימונופלורצנטית לאחר שבא במגע עם הגלאי אבידין-פלורסין (FITC) או anti-digoxigenin-FITC. לצורך ההשוואה, בוצע גם סימון בשיטת primed in situ labeling (PRINS)
בעזרת פלורסין 12-dUTP. טכניקה זו מבוססת על הכנסת dUTP המסומן פלורסנטית לתוך DNA שסונתז תוך שימוש במטרה הגנומית כתבנית ולא על ידי סימון גלאי ה-DNA לפני ההיברידיזציה. בשימוש ב-PRINS יכלו החוקרים לזהות רצף בעל עותק יחיד שהוכן על ידי פרגמנטים בעלי 1.5 Kb של האלל al בגרעין התאים ההפלואידיים של U.
maydis. גודל כזה של גלאי DNA היה קשה לזיהוי באמצעות שיטות אחרות של היברידיזציה in situ.
למרות שגלאים מסומנים בביוטין היו הנפוצים ביותר בסימון לא רדיואקטיבי in situ, הרי שלגישה זו יישומים מוגבלים בפטריות משום שביוטין וחומרים אחרים דמויי ביוטין קיימים במספר מיקרואורגניזמים, כולל בפטריות. רוב הספורדיה של U. maydis סומנו לחלוטים בירוק, תוך שימוש בהיברידיזציה המבוססת על ביוטין-FITC, מה
שמצביע על העובדה כי קיימים מספר חלבונים הדומים לביוטין בפטריה זו. תוצאות אלו מתאימות לתוצאות העולות מניתוח Western Blot.
על מנת לפתור בעיה זו, סומנו גלאי ה-DNA עם דיגוקסיגנין, שהוא סטרואיד המבודד מצמחי דיגיטאליס. מכיוון שהפרחים והעלים של צמחים אלה מהווים את המקור הטבעי היחיד לדיגוקסיגנין, לא מתרחש קישור של נוגדן האנטי-דיגוקסיגנין בחומרים ביולוגיים אחרים. טכניקה זו מנעה את קישור הלא-ספציפי שנצםה בשימוש בשיטות
היברידיזציה המבוססות על סטרפטווידין.
בניסוי של Shuxian וחבריו, זוהה בקלות DNA בעל עותק אחד בעזרת גלאים המסומנים בדיגוקסיגנין al או a2. שתי נקודות טכניות התבררו כקריטיות להצלחת ניסוי זה. ראשית, מעטפת התא חייבת לעבור הידרוליזה באמצעות טיפול בנובוזים על מנת לחדש את חדירות הפטריות לגלאים. שנית, השימוש בתמיסה חוסמת הכרחי על מנת להפחית את
הקישור הלא-ספציפי ברקע בהיברידיזציה in situ.
באמצעות FISH קשה בדרך כלל לזהות גלאים הקטנים מ- 3 Kb, כנראה משום הכמות הקטנה של הצביעה הפלורצנטית הנקשרת לגלאים. נעשה שימוש באוליגונוקליאוטידים על מנת לזהות רצפים חוזרניים של DNAעל ידי FISH, אך הדמיה בעלת ניגוד גבוה מצריכה מצלמה רגישה מאוד. באמצעות שיטת PRINS ניתן להתגבר על בעיה זו משום שעוצמת
האיתות אינה מושפעת מגודל הגלאים. נעשה שימוש בפלורסין על מנת לסמן DNA חדש שסונתז ולא לסימון גלאים.
כאמור, ברוב המחקרים נעשה שימוש בביוטין או בדיגוקסיגנין בסימון הגלאים, מה שמצריך ראגנטים משניים (אבידין, הקשור לפלורסין או רודאמין). אולם, כיום קיימים בשוק נוקליאוטידים מסומנים פלורוסנטית שניתן להכניסם אינזימטית ל-DNA באמצעות שבר (nick translation) או סינתזת פריימר אקראית. גם אוליגונוקליאוטידים
שסומנו כימית יכולים להיות מסומנים ישירות באמצעות מולקולות פלורופור מאוקטבות.
ניתן לראות גלאים מסומנים בפלורופור מייד לאחר השטיפה הראשונה שלאחר ההיברידיזציה להסרת הגלאים העודפים, ובכך נמנע השימוש באינקובציה שניה והשטיפות הדרושות על מנת לאתר גלאים המסומנים בהפטן. זהו יתרון חשוב, משום שבכך מצטמצמים הזמן והמאמצים הדרושים להשלמת ניסוי. אולם, עוצמת הסיגנל המתקבלת על ידי גלאים
פלורפוריים עומדת על כ- 10%-15% מזו המתקבלת מגלאים הפטניים אקוויוואלנטיים המזוהים על ידי ריאגנט שני. כמו כן, גלאים פלורופוריים נוטים גם להלבנת התמונות במשך ההכנות וההיברידיזציה, ולכן חשוב להימנע מחשיפה ארוכהמדי לאור חזק. בנוסף, הפלורוסנציה של הגלאים המסמנים ישירות נכבית על ידי חומרים רוטיניים רבים,
ולכן יישומים היסטוכימיים קונבנציונאליים רבים, כמו ביוטין או דיגוקסיגנין, מועדפים לסימון גלאים. למרות זאת, גלאים פלורופוריים המסמנים ישירות מציעים יתרונות ספציפיים - רעש רקע פלורוסנטי נמוך מאוד, פוטנציאל גבוה לניתוח מורכב של רצפי מטרה וניתוח כמותי של תכולת חומצות הגרעין של חלקי התא.
במחקרם, הציגו Ballard Ward דוגמאות של FISH למיפוי גנים בכרומוזומים אנושיים הנמצאים בשלב המטאפאזה, לזיהוי מערכים לא שלמים של כרומוזומים וטראנסלוקציות בתאי דם פריפריים לא-מיטוטיים, ולאיתור מיקומם של SNRPs. כמו כן דנו החוקרים ביתרונותיה וחסרונותיה של שיטת ההדמיה הדיגיטלית בה השתמשו.
במקרה של רוטינות קליניות עולה הצורך להאיץ ולהפוך את תהליך ההיברידיזציה לאוטומאטי יותר. צעד שימושי להשיג זאת היה ריאקציות PCR לאמפליפיקציית גלאים ל-FISH. כמו כן, נעשה שימוש בצירוף הכנסה ישירה של נוקליאוטידים מסומנים, כך שעלה הצורך ב- nick translation.
לאחרונה הועלתה אלטרנטיבה מעניינת ל-FISH הקלאסי, שהיא כאמור ה-PRINS. למרות שניתן להפוך את טכניקת PRINS לאוטומאטית מאוד, אחד מחסרונותיה הוא הצורך בכמויות גבוהות של גלאי ה-DNA והסובסטראט על מנת להשיג תוצאות טובות המגיעות אף הן לאחר לפחות 30 דקות, וגם אז עוצמת האיתות דומה לעוצמה המתקבלת ב-FISH קלאסי.
לכן, במיוחד באפליקציות רוטיניות, פרוטוקולי FISH מהירים מספיק עשויים להשלים את השימוש בטכניקת PRINS. הדו"חות הראשונים שפורסמו על FISH לגבי גלאי ה-DNA הצביעו על כך כי רוב המעבדות השתמשו בכמויות גבוהות של פורמאמיד או גורם דנטורציה אחר בבופר הדנטורציה על מנת להעלות את יעילות השיטה. כתוצאה מכך, מספר היה
צורך במספר שלבי שטיפה שצרכו זמן רב. במאמרם , מתארים Celeda וחבריו מחקר סיסטמטי כמותי לגבי שיטת היברידיזציה לא-אינזימתית מהירה אלטרנטיבית, הנמנעת משימוש בפומאמיד או בגורם דנטורציה אחר, וכתוצאה מכך מורידה את מזפר השטיפות ההכרחיות באופן דראסטי.
עד כה, עסקו מאות הפירסומים על שיטת FISH בתיאור איכותי של תוצאות ההיברידיזציה. הכימות הוגבל בדרך כלל לספירת הכתמים, לקביעת מרחקי הכתמים בגרעין, או למספור האברציות הכרומוזומליות. לאחרונה, פורסמו יותר מחקרים כמותיים העוסקים בתכולת הפלורסנציה של אותות ה-FISH. מחקרים אלה מיישמים את פיתוח מיקרוסקופיית
ההדמיה הדיגיטלית עם מצלמות CCD בשחור לבן. Celeda וחבריו משתמשים במצלמת CCD צבעונית במיקרוסקופ פלורסנטי. על מנת לקבל מידע כמותי מנסיונות FISH אלה, נלקחו כמערכת מודל לימפוציטים מן הדם הפריפרי האנושי שעברו היברידיזציה עם גלאי DNA חוזרניים. אותו ה-FISH הדיגיטליים הוגברו תוך שימוש בתוכנת הדמיה נפוצה.
מאחר והארגון האינסטרומנטלי האופטימלי אינו נפרד מפרוטוקול ההיברידיזציה האופטימלי ולהיפך, מרכיבים מסחריים אלה עשויים להציע סטנדרט מסויים להשוואת תוצאות פלורסנטיות של שיטות היברידיזציה שונות.
לסיכום
כיום מהווה הפלורסנציה את הכלי האופטי הפופולארי ביותר למדידת תכונות יוניות בתוך תאים חיים, מןהסיבות הבאות:
רגישותה הרבה של השיטה. ניתן לאבחן כיום מספר קטן מאוד של מולקולות פלורסנט, ונראה כי מספר זה ישתפר עם ההתקדמות בכימיית הגלאים והמיכון.
הספציפיות - קבוצות יחידות של תאים יכולות להילמד בתוך תערובת של מולקולות רבות אחרות באמצעות בחירת גלאים מתאימים וצירופי פילטרים.
ספקטרוסקופיה - האינפורמציה על המולקולות וסביבתן יכולה להיות מושגת ממדידות ספקטרוסקופיות.
רזולוציה מרחבית - הפלורסנציה מאפשרת את ניתוח הפרמטרים הפלורסנטיים בגבול ההפרדה של מיקרוסקופ האור. ניתן, לכן, ליצור מפות דו- ותלת-מימדיות של ההתפלגות והפעילות המולקולרית בתאים.
הרזולוציה בזמן - ניתן למדוד באמצעות פלורסנציה תהליכים תלויים בזמן.
רוב הצבעים הפלורסנטיים מוכנסים לתא באופן לא פולשני.
אין ספק כי שיטה זו תמשיך לשרת את מדעי החיים והרפואה גם בשנים הבאות, תוך פיתוח והתקדמות מתמידים.
ביבליוגרפיה
Anastasi J, et al., "Detection of Numerical Chromosomal Abnormalities in Neoplastic Hematopietic Cell by in Situ Hybridization with a Chromosome Specific Probe", Am J Pathol, 136, pp. 131-139, 1990.
Ballard, S. G, Ward, D. C, "Fluorescence In Situ Hybridization Using Digital Imaging Microscopy", Jour Histochem Cytochem, 41(12), pp. 1755-1759, 1993.
Bauman J. G. J, et al., "A New Method for Fluorecence Microscopial Localization of Specific DNA Sequence by in Situ Hybridization of Fluorochrome-Labelled RNA", Exp Cell Res, 128, pp. 485-490, 1980.
Burgenhout, W, Humangenetik, 29, pp. 229-231, 1975.
Caspersson T, et al., Exp Cell Res, 49, pp, 219-222, 1968.
Celeda D, et al., "Rapid Fluorescence In Situ Hybridization with Repetitive DNA Probes: Quantification by Digital Image Analysis", cytometry, 17, pp. 13-25, 1994.
Cremer C, et al., "Preparative Dual Beam Sorting of the Human Y Chromosome and in Situ Hybridization of Cloned DNA Probes", Hum Genet, 5, pp. 572-579, 1984.
Cremer T, et al., "Non-Isotopic in Situ Hybridization and Digital Image Analysis of Chromosomes in Mitotic and Interphase Cells", Rev Eur Technol Biomed, 13, pp. 50-54, 1991.
Cremer T, et al., "Detection of Chromosome Abberrations in Metaphase and Interphase Tumor Cells by in Situ Hybridization Using Chromosome Specific Library Probes", Hum Gen, 80, pp. 235-246, 1988.
Cremer T, et al., "Detection of Chromosome Aberration in the Human Interphase Nucleus by Visualization of Specific Target DNAs with Radioactive and Non-Radioactive in Situ Hybridization Techniques. Diagnosis of Trisomy 18 with Probe L1.84", Hum Genet, 74, pp. 346-352, 1986.
Du-Manoir S, et al., "Detection of Complete and Partial Chromosome Gains and Losses by Comparative Genomic in Situ Hybridization", Hum Genet, 90, pp. 590-610, 1993.
Dunham I, et el., "Rapid Generation of Chromosome-Specific Alphoid DNA Probes Using the Polymerase Chain Reaction", Hum Genet, 88, pp. 457-462, 1992.
Gall, J. G, Pardue, M. L, "Formation and Detection of RNA-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations", Proc Natl Acad Sci USA, 63, pp. 378-383, 1969.
John H, et al., "RNA-DNA Hybrids at the Cytological Level", Nature, 223, pp. 582-587, 1969.
Landegent J. E, et al., "Chromosomal Location of a Unique Gene by Nonautoradiographic in Situ Hybridization", nature, 317, pp. 175-177, 1985.
Lawrence J. B, et el., "Sensitive High-Resolution Chromatin and Chromosome Mappings in Situ: Presence and Orientation of Two Closely Integrated Copies of EBV in a Lymphoma Line", Cell, 249, pp. 928-932, 1988.
Lichter P, et al., "Analysis of Genes and Chromosomes by Non-Isotopic in Situ Hybridization", Genet Anal Technol Appl, 8, pp. 24-35, 1991.
Lichter P, et al., "High Resolution Mapping of Human Chromosome 11 by in Situ Hybridization with Cosmid Clones", Science, 24, pp. 64-69, 1990.
Matera, A.G, Ward, D. C, "Oligonucleotide Probes for the Analysis of Specific Repetitive DNA Sequences by Fluorescence in Situ Hybridization", Hum Mol Genet, 1, pp. 535-539, 1992.
Nederlof P. M, et al., "Fluorescence Ratio Mesurements of Double-Labelled Probes for Multiple In Situ Hybridization By Digital Imaging Microscopy", Cytometry, 13, pp. 839-845, 1992.
Nederlof P. M, et al., "Three-Color Fluorescence in Situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Multiple Nucleic Acid Sequences", Cytometry, 10, pp. 20-27, 1989.
Pinkel D, et al., "Cytogenetic Analysis Using Quantitative, High-Sensitivity, Fluorescence Hybridization", Proc Natl Acad Sci USA, 83, pp. 2934-2938, 1986.
Rudkin, G. T, Stollar, B. D, Nature, 265, p. 472, 1977.
Shuxian L, et al., "Comparsion of Fluorescence in Situ Hybridization and Primes in Situ Labeling Methods for Detection of Single-Copy Genes in the Fungus Ustilago maydis", Exp Mycol, 17, pp. 301-308, 1993.
Wiegant J, et al., "In Situ Hybridization with Fluoresceinated DNA", Nucleic Acids Rea, 19, pp. 3237-3241, 1991.
T. Cremer et al., "Detection of Chromosome Aberration in the Human Interphase Nucleus by Visualization of Specific Target DNAs with Radioactive and Non-Radioactive in Situ Hybridization Techniques. Diagnosis of Trisomy 18 with Probe L1.84", Hum Genet, 74, pp. 346-352, 1986.
P. Lichter et al., "Analysis of Genes and Chromosomes by Non-Isotopic in Situ Hybridization", Genet Anal Technol Appl, 8, pp. 24-35, 1991.
T. Cremer et al., "Non-Isotopic in Situ Hybridization and Digital Image Analysis of Chromosomes in Mitotic and Interphase Cells", Rev Eur Technol Biomed, 13, pp. 50-54, 1991.
T. Cremer et al., "Detection of Chromosome Abberrations in Metaphase and Interphase Tumor Cells by in Situ Hybridization Using Chromosome Specific Library Probes", Hum Gen, 80, pp. 235-246, 1988.
C. Cremer et al., "Preparative Dual Beam Sorting of the Human Y Chromosome and in Situ Hybridization of Cloned DNA Probes", Hum Genet, 5, pp. 572-579, 1984.
S. Du-Manoir et al., "Detection of Complete and Partial Chromosome Gains and Losses by Comparative Genomic in Situ Hybridization", Hum Genet, 90, pp. 590-610, 1993.
J. Anastasi et al., "Detection of Numerical Chromosomal Abnormalities in Neoplastic Hematopietic Cell by in Situ Hybridization with a Chromosome Specific Probe", Am J Pathol, 136, pp. 131-139, 1990.
G. T. Rudkin, B. D. Stollar, Nature, 265, p. 472, 1977.
J. G. J. Bauman et al., "A New Method for Fluorecence Microscopial Localization of Specific DNA Sequence by in Situ Hybridization of Fluorochrome-Labelled RNA", Exp Cell Res, 128, pp. 485-490, 1980.
J. G. J. Bauman et al., there, p. 489.
T. Caspersson et al., Exp Cell Res, 49, pp, 219-222, 1968.
W. Burgenhout, Humangenetik, 29, pp. 229-231, 1975.
D. Pinkel et al., "Cytogenetic Analysis Using Quantitative, High-Sensitivity, Fluorescence Hybridization", Proc Natl Acad Sci USA, 83, pp. 2934-2938, 1986.
D. Pinkel et al., there, p. 2938.
J. G. Gall, M. L. Pardue, "Formation and Detection of RNA-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations", Proc Natl Acad Sci USA, 63, pp. 378-383, 1969.
H. John et al., "RNA-DNA Hybrids at the Cytological Level", Nature, 223, pp. 582-587, 1969.
J. E. Landegent et al., "Chromosomal Location of a Unique Gene by Nonautoradiographic in Situ Hybridization", nature, 317, pp. 175-177, 1985; J. B. Lawrence et el., "Sensitive High-Resolution Chromatin and Chromosome Mappings in Situ: Presence and Orientation of Two Closely Integrated Copies of
EBV in a Lymphoma Line", Cell, 249, pp. 928-932, 1988; P. Lichter et al., "High Resolution Mapping of Human Chromosome 11 by in Situ Hybridization with Cosmid Clones", Science, 24, pp. 64-69, 1990; J. Wiegant et al., "In Situ Hybridization with Fluoresceinated DNA", Nucleic Acids Rea, 19, pp.
3237-3241, 1991.
P. M. Nederlof et al., "Three-Color Fluorescence in Situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Multiple Nucleic Acid Sequences", Cytometry, 10, pp. 20-27, 1989.
L. Shuxian et al., "Comparsion of Fluorescence in Situ Hybridization and Primes in Situ Labeling Methods for Detection of Single-Copy Genes in the Fungus Ustilago maydis", Exp Mycol, 17, pp. 301-308, 1993.
A. G. Matera, D. C. Ward, "Oligonucleotide Probes for the Analysis of Specific Repetitive DNA Sequences by Fluorescence in Situ Hybridization", Hum Mol Genet, 1, pp. 535-539, 1992.
L. Shuxian et al., there, p. 307.
S. G. Ballard, D. C. Ward, "Fluorescence In Situ Hybridization Using Digital Imaging Microscopy", Jour Histochem Cytochem, 41(12), pp. 1755-1759, 1993.
I. Dunham et el., "Rapid Generation of Chromosome-Specific Alphoid DNA Probes Using the Polymerase Chain Reaction", Hum Genet, 88, pp. 457-462, 1992.
D. Celeda et al., "Rapid Fluorescence In Situ Hybridization with Repetitive DNA Probes: Quantification by Digital Image Analysis", cytometry, 17, pp. 13-25, 1994.
P. M. Nederlof et al., "Fluorescence Ratio Mesurements of Double-Labelled Probes for Multiple In Situ Hybridization By Digital Imaging Microscopy", Cytometry, 13, pp. 839-845, 1992.

תגים:

מולקולות · פלורסנטיות · and

אפשרויות משלוח:

ניתן לקבל ולהזמין עבודה זו באופן מיידי במאגר העבודות של יובנק. כל עבודה אקדמית בנושא "טכניקת FISH במחקר הציטוגני", סמינריון אודות "טכניקת FISH במחקר הציטוגני" או עבודת מחקר בנושא ניתנת להזמנה ולהורדה אוטומטית לאחר ביצוע התשלום.

אפשרויות תשלום:

ניתן לשלם עבור כל העבודות האקדמיות, סמינריונים, ועבודות המחקר בעזרת כרטיסי ויזה ומאסטרקרד 24 שעות ביממה.