דיכוי זמני של תפקוד מאקרופאגים ע"י ליפוזומים המכילים תרופות (בטחול ובכבד של חולדות)

תקציר העבודה:

דיכוי זמני של תפקוד מאקרופאגים
על ידי ליפוזומים המכילים תרופות
hc1465

המחקרים יסומנו במספרים מ1 - עד . 5
מטרות המחקר:
ניתן להבחין בין שלושה סוגי מאקרופאגים בטחול: ,red pulp macrophages
(MMM) marginal metallophilic macrophages (RPM), וmarginal zone -
MZM) macrophages). שלושת הקבוצות מומתות 24 שעות לאחר פאגוציטוזה של
ליפוזומים שבתוכם DMDP) dichloromethylene diphosphonate), לאחר שחרור
החומר בתוך המאקרופאג (שיטה יעילה לפגיעה סלקטיבית באוכלוסיית
המאקרופאגים). בנוסף נראים שינויים בחלק מאוכלוסיית הלימפוציטים בטחול.
מטרת המחקר היא לבדוק את הקינטיקה השונה של הופעתן מחדש של הקבוצות
השונות של המאקרופאגים והלימפוציטים לאחר טיפול ספציפי בליפוזומים, ביחס
ליחסי הגומלין הפנימיים שבין הקבוצות.
מטרת המחקר היא ללמוד את ההיבטים התפקודיים והקינטיקה של
מאקרופאגים בטחול ובכבד של חולדות, בשונה מעכברים בהם נעשה הניסוי
הקודם, תוך אלימינציה סלקטיבית שלהם מבלי לפגוע בתאים אחרים במהלך
הניסוי, באמצעות שימוש בC12MDP- הכלוא בליפוזומים.
המחקר משווה בין השפעתם של שלושה חומרים שונים: Clodronate, Propamidine
וEDTA-, המוכלים בתוך ליפוזומים, על פעילותם של מאקרופאגים מסוג Kupffer
Cells בכבד של חולדות. שלושת החומרים מייצגים שלוש משפחות שונות:
,Bisphosphonates, Diamidines וPolyaminopolycarboxylic Acid-, בהתאמה.
המחקר בא ללמוד את מנגנון מות תאי המאקרופאגים שהושרה על ידי
פאגוציטוזה של חומרים המוכלים בליפוזומים In Vitro. לצורך כך הושרו תרביות
תאים של מאקרופאגים צפקיים (Peritoneal), דהיינו תאים פאגוציטיים שאינם
בהתבסס על ההנחה כי מאקרופאגים רקמתיים מעמידים מכשול בפני העברת גנים
ע"י וקטורים הנמצאים באדנו-וירוסים (Ad) לאיברים פנימיים, מנסה המחקר
לבדוק את השפעת קטילתם של Kupffer Cells על ידי ליפוזומים המכילים
dichloromethylene-bisphosphon- ate, על העברתם של וקטורים גנומיים של Ad
והתבטאותם של הגנים בכבד של מספר חיות ניסוי.

מקורות:

1379
דיכוי זמני של תפקוד מאקרופאגים על ידי ליפוזומים המכילים תרופות
המחקרים יסומנו במספרים מ- 1 עד 5 .
מטרות המחקר:
ניתן להבחין בין שלושה סוגי מאקרופאגים בטחול: ,red pulp macrophages (RPM) marginal metallophilic macrophages (MMM), ו-marginal zone macrophages (MZM). שלושת הקבוצות מומתות 24 שעות לאחר פאגוציטוזה של ליפוזומים שבתוכם dichloromethylene diphosphonate (DMDP), לאחר שחרור החומר בתוך המאקרופאג (שיטה יעילה
לפגיעה סלקטיבית באוכלוסיית המאקרופאגים). בנוסף נראים שינויים בחלק מאוכלוסיית הלימפוציטים בטחול. מטרת המחקר היא לבדוק את הקינטיקה השונה של הופעתן מחדש של הקבוצות השונות של המאקרופאגים והלימפוציטים לאחר טיפול ספציפי בליפוזומים, ביחס ליחסי הגומלין הפנימיים שבין הקבוצות.
מטרת המחקר היא ללמוד את ההיבטים התפקודיים והקינטיקה של מאקרופאגים בטחול ובכבד של חולדות, בשונה מעכברים בהם נעשה הניסוי הקודם, תוך אלימינציה סלקטיבית שלהם מבלי לפגוע בתאים אחרים במהלך הניסוי, באמצעות שימוש ב-C12MDP הכלוא בליפוזומים.
המחקר משווה בין השפעתם של שלושה חומרים שונים: Clodronate, Propamidine ו-EDTA, המוכלים בתוך ליפוזומים, על פעילותם של מאקרופאגים מסוג Kupffer Cells בכבד של חולדות. שלושת החומרים מייצגים שלוש משפחות שונות: Bisphosphonates, Diamidines, ו-Polyaminopolycarboxylic Acid, בהתאמה.
המחקר בא ללמוד את מנגנון מות תאי המאקרופאגים שהושרה על ידי פאגוציטוזה של חומרים המוכלים בליפוזומים In Vitro. לצורך כך הושרו תרביות תאים של מאקרופאגים צפקיים (Peritoneal), דהיינו תאים פאגוציטיים שאינם עוברים פרוליפרציה, ומאקרופאגים מסוג RAW 264, העוברים פרוליפרציה מהירה, עם ליפוזומים המכילים
Clodronate, Propamidine, ו-EDTA.
בהתבסס על ההנחה כי מאקרופאגים רקמתיים מעמידים מכשול בפני העברת גנים ע"י וקטורים הנמצאים באדנו-וירוסים (Ad) לאיברים פנימיים, מנסה המחקר לבדוק את השפעת קטילתם של Kupffer Cells על ידי ליפוזומים המכילים dichloromethylene-bisphosphon- ate, על העברתם של וקטורים גנומיים של Ad והתבטאותם של הגנים בכבד של
מספר חיות ניסוי.
מערכות הניסוי והמדידה
נעשה שימוש בנקבות עכברים שקיבלו זריקה תוך ורידית אחת או שתיים של ליפוזומים עם DMDP. העכברות הומתו במרווחי זמן שונים לאחר ההזרקה, לבדיקת הטחול שלהן. עכברות הבקרה קיבלו זריקות סליין או ליפוזומים ריקים. הליפוזומים הוכנו באמצעות פוספאטידילכולין וכולסטרול שהומסו בכלורופורם, אליהם הוסף בופר PBS. DMDP
הוסף ל-PBS ולליפוזומים. פיסות טחול הוקפאו בחנקן נוזלי. פרוסות בנות מיקרומטרים קובעו באצטון, יובשו, נשטפו והודגרו עם מגוון נוגדנים מונוקלונאליים של תאים לימפטיים ולא לימפטיים בריכוזי רוויה עם PBS ו-BSA. פיסות הטחול הודגרו עם פרוקסידאז-IgG ממוצא ארנבי, PBS-BSA וסרום עכברי. לאחר שטיפה נצבעו הפיסות
לזיהוי פעילות הפרוקסידאז. תאי B מן הטחול נצבעו ע"י פרוקסידאז-IgG ממוצא עיזי. המאקרופאגים נצבעו על ידי נוגדנים מתאימים. לאחר שטיפות נוספות נקבעה פעילותם ע"י גלאי המאקרופאגים F4/80 ו- MOMA-2.
נקבות חולדות קיבלו זריקה אחת תוך-ורידית של ליפוזומים המכילים C12MDP והומתו במרווחי זמן שונים. נלקחו דוגמאות רקמה מן הטחול, הכבד, הראות, בלוטות הלימפה, peyer's patches, מח העצם וה-thymus. הליפוזומים הוכנו כפי שהוכנו בניסוי הקודם. גם בניסוי זה נעשה שימוש בשיטת אימונו-פרוקסידאז: הפיסות הודגרו עם
נוגדנים מונוקלונאלים מתאימים הקשורים לפרוקסידאז (המזהים קבוצות שונות של מאקרופאגים), תוך זיהוי פעילות הפרוקסידאז. הפיסות נצבעו, ונקבעה פעילות ה-acid phosphatase.
הליפוזומים הוכנו בצורה דומה לניסויים הקודמים, רק שהפעם הוכנסו לתוכם Clodronate, propamidine, ו-EDTA. קביעת תאי Kupffer בכבד נעשתה גם היא בדומה לניסויים הקודמים: כבדים וטחולים של החולדות הוסרו יומיים לאחר מתן הליפוזומים, ונבדקו בשיטת אימונו-פרוקסידאז.
מאקרופאגים מסוג RAW 264 גודלו כתרבית תאים עם מדיום RPMI המכיל סרום של עגל שזה עתה נולד. חיות התאים נקבעה על ידי באמצעות מבחן trypan blue. נקבעה קינטיקת המוות התאי של RAW 264 לאחר הוספת הכמויות השונות של הליפוזומים, ביחס לתרבית תאי הבקרה. תאי המאקרופאגים הצפקיים בודדו מנקבת עכבר גם הם על ידי שטיפה
ב-RPMI המכיל סרום של עגל שזה עתה נולד. הליפוזומים הכילו EDTA, הכולל קומפלקסים של סידן ונחושת, clodronate ו-propamidine, שהוכחו כיעילים באפופטוזיס התאי. האחרונים הוכחו כיעילים במיוחד כגורמים אנטי-מיקרוביאלים ליפוזומליים מכיוון שלשרשרת האלקיל הקצרה שלהם תכונות ליפופיליות מינימליות, וצפויה, לכן, דליפה
מינימלית מן הליפוזום וצבירה מקסימלית בתאים הפאגוציטיים. בנוסף על כך הוראה עד כה כי ל- propamidine יש את ההשפעה היעילה ביותר על הריגת מאקרופאגים בכבד. כל התרכובות הוכנסו לליפוזומים כפי שתואר בניסויים הקודמים.
מידת האפופטוזיס נקבעה בהתאם לשיטת הזרימה הציטומטרית המבוססת על ההנחה כי השריית אפופטוזיס מלווה בהופעת פסגה מקומית של G1 בהיסטוגרמת ה-DNA. על מנת לקשר בין תוצאות הציטומטריה לנוכחות מקטעי DNA אוליגונוקליאוזומלי, הודגרו תאי RAW 264 עם ליפוזומים המכילים propamidine או PBS. לאחר שנשטפו התאים, הם הודגרו
ב-digestion buffer, טופלו ב-RNAse ואתנול ועבר אלקטרופורזה באגארוז ג'ל המכיל אתידיום ברומיד. לאחר האלקטרופורזה נבחן הג'ל תחת אור UV.
תאי kupffer הומתו in vivo באמצעות הזרקה תוך-ורידית של ליפוזומים המכילים Clordonate, כמתואר בניסוי השלישי. בליפוזומים המכילים Clordonate נעשה שימוש שלושה ימים לאחר הכנתם. ניסויי הבקרה כללו הזרקות תוך-ורידיות של ליפוזומים עם PBS בלבד, או Clordonate בלבד. מותם של תאי Kupffer אושר באמצעות ניתוח
אימונו-היסטוכימי בחלקי כבד של בעלי החיים באמצעות הנוגדן המונוקלונאלי F4/80. כימות התאים שהראו תגובה חיובית לנוגדנים נקבע על ידי שני תצפיתנים שאינם קשורים לניסוי שבדקו מדגמים באקראי. וקטור ה-Ad הרקומביננטי מכיל קסטת התבטאות, דהיינו פרומוטור/אנהנסור, רצף שיחבור מלאכותי, גן CAT בקטריאלי וקודון עצירה.
בניסוי נעשה שימוש בעכברים משני המינים בני 3-4 שבועות. בעת הזרקת חומרי הניסוי הורדמו העכברים, ויומיים לאחר מכן, בעת שהירידה במספר תאי Kupffer הייתה מקסימלית, הוזרק הוקטור. החיות הומתו במרווחי זמן שונים, וכבדן נבדק. חלק מן הכבד שימש לניתוח ביטוי CAT, וחלק אחר שימש למיצוי ה-DNA הוקטורי.
כל המידע עבר ניתוח סטטיסטי והוצגו הממוצעים ± סטיית התקן שלו.
תקינות הליפוזומים ומערכות הניסוי:
בהנחה כי נלקחו בחשבון זמני מחצית החיים של הליפוזומים, נראה כי הליפוזומים היו תקינים בניסויים. החומרים הכלואים בתוך הליפוזומים הוכחו כיעילים במנגנון 'התאבדות' המאקרופאגים, ומתאימים להיות כלואים בהם מאחר ואין הם דולפים (שכן הם חסרי פעילות ליפוליפית) ובעלי כושר הצטברות מקסימלי במאקרופאגים.
חיות הניסוי ותרביות התאים:
נראה כי חיות הניסוי (עכברים וחולדות) מהוות מודלים מתאימים למטרות העבודה בשלב זה של המחקר. בעתיד יש להמשיך ולבצע ניסויים בחיות ניסוי גדולות יותר, עד שלב הטיפול בבני אדם, שכן אין ודאות כי בחיות אחרות יפעלו המערכות והמנגנונים באותה צורה, למרות שיש להניח (ולקוות) כי כיווני הפעולה יהיו דומים. נכון היה
לבדוק גם את הפעילות במערכת in vitro, בתרביות תאים, על מנת לנסות ולבודד את ההשפעות החיצוניות למערכת הניסוי.
ממצאי המחקרים:
שלושת סוגי המאקרופאגים אותרו לאחר פעילות הפוספאטאז ולאחר שנצבעו על ידי MOMA-1. MZM עיכלו FITC-Ficoll, ונצבעו על ידי ERTR9. פעילות IgM חשפה את פיזור הלימפוציטים בטחול. הטיפול בליפוזומים שהכילו DMDP השפיע על כל המאקרופאגים ועל חלק מתאי הלימפוציטים B בטחול, אך לימפוציטים מסוג T ו-IDC לא הושפעו. לא
נמצאו הבדלים מהותיים בהשפעת ליפוזומי ה-DMDP כשהוזרקו פעם אחת או פעמיים. יום לאחר הטיפול נעלמו כל המאקרופאגים בחלק האדום של הטחול, והותירו רק שרידי תאים. בניגוד לשינויים הדראסטיים בחלק האדום, לא הומתו לגמרי המאקרופאגים בחלק הלבן של הטחול, למרות שמספרם ירד עד כדי 50%. שאריות התאים נבלעו. כ- 80% מתאי
B ב-marginal zone בטחול נעלמו תוך יום אחד של טיפול, וחלק קטן מהם נותר במשך השבוע הראשון של הניסוי.
RPM היו הראשונים להופיע שוב בטחול. איכלוס מהיר מחדש של התאים הללו התרחש בד"כ כ- 6 ימים לאחר הטיפול, והם הגיעו לריכוזם הנורמלי בסביבות היום העשירי. בערך בזמן זה החלו להופיע מחדש MMM, שהיו בעלי מראה עגול ולא מוארך כרגיל. בערך ביום ה- 16 הגיעו ה-MMM לריכוזם הנורמלי ועיצבו את מראם האופייני בגבול שבין
החלק הלבן לשולי בטחול. בזמן זה החלו להופיע התאים שהגיבו ל-ERTR9, אך לקח להם כחודש להגיע לריכוזם ופעילותן הנורמלים. מאקרופאגים באזור הלבן, שלא מתו לגמרי, חזרו למצבם הטבעי לאחר 8 ימים. אוכלוסיית תאי B באזור השולי שוקמה לחלוטין לאחר 12-16 ימים, הרבה לפני המאקרופאגים האופייניים לאזורים השוליים של
הטחול.
סוגי המאקרופאגים השונים אותרו במקומות הצפויים בטחול באמצעות המארקרים. יומיים לאחר הטיפול, נעלמו רוב התאים (RPM, MMM, MZM) מן הטחול, אך נותרו שיירי תאים. ביום ה- 8 החלו להופיע חלק מן התאים (MZM, RPM) בחלק האדום, וביום ה- 16 הופיעו האחרים. ביום ה- 32 עד ה- 65 חזרו כל התאים לריכוזם הנורמלי.
בכבד נעלמו תאי Kupffer יומיים לאחר הטיפול בליפוזומים שכלאו C12MDP, והעלמם נמשך עד היום השמיני. ביום ה- 16 שבו התאים לריכוזם הנורמלי בכבד.
גם באיברים אחרים בגוף החולדות נעלמו המאקרופאגים לאחר הטיפול בליפוזומים שכלאו CMDP. במפתיע הופיעו מספר תאים מחדש במקומות בהם לא היו צפויים להופיע ביום ה- 16, כמו באזורי תאי T של הלימפה, במדולה של התימוס, וסביב כלי דם בראות.
דפוסי הפיזור של המאקרופאגים בכבד והירידה בכמותם ביום השני לאחר הטיפול בליפוזומים שכלאו Clodronate התאימו לניסויים הקודמים. בטחול הושגה המתתם של רוב המאקרופאגים בחלק האדום על ידי הזרקת ליפוזומים שכלאו Clodronate, Propamidine או EDTA, כשהחומרים היו בריכוזים הגבוהים ביותר. המאקרופאגים בחלק הלבן לא
נעלמו, אך צורתם השתנתה. בריכוזים נמוכים יותר לא נעלמו כל המאקרופאגים, ובמיוחד שרדו MMM ו-RPM.
נמצאו הריכוזים המינימליים להמתת רוב המאקרופאגים של Clodronate ו-Prpopamidine (0.077 mol/L ו- 0.009 mol/L בהתאמה). הליפוזומים שכלאו EDTA, שהיו יעילים בהמתת המאקרופאגים בטחול, הן בעכבר והן בחולדה, לא הביאו למות תאי Kupffer בכבד החולדות, אפילו בריכוזים גבוהים. תאים אלה רק שינו את צורתם בדומה
למאקרופאגים בחלק הלבן של הטחול.
האפופטוזיס של המאקרופאגים נקבע 24-72 שעות לאחר מתן הליפוזומים שכלאו את התרופות. תאי הבקרה הראו אחוז נמוך של אפופטוזיס בהעדר הליפוזומים. המאקרופאגים משני המינים שהודגרו בתרבית התאים עם הליפוזומים שכלאו Clodronate או Propamidine ל- 24 שעות או יותר הראו יותר מ- 16% אפופטוזיס. לאחר 48 שעות נצפו 34%-48%
אפופטוזיס, ולאחר 72 שעות הראו התאים שיעור של 43%-71% אפופטוזיס.
בהיסטוגרמת ה-DNA הראו תאי RAW 264 שהושרו עם ליפוזומים הכולאים EDTA שיא מקומי קטן של G1 הקרוב יותר לשיא הכללי של G1, ביחס לשימוש ב-Clodronate ו-Propamidine. תאים אלה, כשהודגרו עם ליפוזומים שכלאו קלציום-EDTA לא הראו כלל תת-שיא של G1, אך משהודגרו עם ליפוזומים הכולאים נחושת-EDTA הראתה היסטוגרמת ה-DNA
תתא-שיא ברור.
על מנת לוודא כי לתתי-השיא של G1 יש קורלציה למקטעי DNA נתבצעה אלקטרופורזה. תוצאות האלקטרופורזה מראות כי תוספת הליפוזומים שהכילו Propamidine גרמו לפרגמנטציה של ה-DNA בתאי RAW 264.
גם כאן נצפתה ירידה חדה בתאי Kupffer בכבד יומיים לאחר הטיפול בליפוזומים. השפעת הירידה החדה בתאי Kupffer על העברת הגנים באמצעות הוקטור נמדדה באמצעות השוואת פעילות CAT הטרנסגני בכבד 7 ימים לאחר הזרקת הוקטור בין חיות הבקרה להן הוזרק רק הוקטור לבין חיות הניסוי שקיבלו גם ליפוזומים המכילים . לא נמצאו
הבדלים בהתבטאות CAT 7 ימים לאחר הטיפול בוקטור בין העכברים שקיבלו ליפוזומים יומיים לפני כן לבין אלו שטופלו ב-PBS או ליפוזומים ריקים. בניגוד לכך, ביטוי ה-CAT בכבדי חיות שטופלו מראש בליפוזומים המכילים היה גבוה הרבה יותר מאשר בחיות הבקרה.
ביטוי CAT הואץ בקבוצות שקיבלו ליפוזומים המכילים בכל נקודות הזמן, מיום אחד ועד ארבעה שבועות בסדרי גודל של פי 7-13. כמות הגנום הוקטורי בכבד תאם לתוצאות התבטאות CAT. כמות הוקטור בחיות שטופלו בליפוזומים היה לפחות פי שניים מזה שאצל קבוצות הבקרה, ובשבוע הרביעי נמצא בחיות הניסוי אותו ערך שנמצא בחיות
הבקרה בשבוע הראשון, דהיינו פי 10 ממה שנמצא בחיות הבקרה באותו זמן. התוצאות הראו כי לא רק שהטיפול המוקדם בליפוזומים הניב עליה בכמות ה-DNA הוקטורי ובביטוי CAT ביום הראשון, אלא שהשפעות אלה התקיימו בעקביות לאורך זמן. למרות ההגדלה הניכרת של ריכוז
הוקטור לאחר הטיפול ב-, הרי שטיפול זה לא מנע את התפתחותם של תאי CTL ושל תגובה חיסונית ישירה כנגד הוקטור.
מסקנות החוקרים:
כל המאקרופאגים בטחול מושפעים על ידי הזרקה תוך-ורידית של ליפוזומים המכילים DMDP. ליפוזומים אלה מעוכלים על ידי המאקרופאגים והתרופות משוחררות לתוך החלק הפנימי של התא ברגע שמפורק קרום הפוספוליפידים הדו-שכבתי הליפוזומלי באמצעות פוספוליפאזות, הקיימים בחלק הליזוזומי של התאים. כל המאקרופאגים, למעט אלה בחלק
הלבן של הטחול, הומתו, משום שהאחרונים אינם ממוקמים ליד זרם הדם המרכזי בטחול. התוצאות מראות כי המאקרופאגים מוכחדים על ידי הליפוזומים הכולאים DMDP רק כאשר מאפשרים לתרופה להגיע לריכוז אופטימלי בתאים בזמן קצר יחסית. יתכן והסיבה לכך היא כי שחרור התרופה בתאים לאחר עיכול הקרום הליפוזומלי הוא הדרגתי הודות
למעבר בממברנה. הממצא העיקרי של המחקר הוא כי לאחר המתת המאקרופאגים בחלק האדום והשולי, הראו תתי-האוכלוסיות השונות של המאקרופאגים בטחול קינטיקות שונות מאוד מבחינת הופעתן מחדש. שוני זה מצביע על האפשרות כי ל-RPM, MMM, ו-MZM פרקורסרים שונים, הבאים, כנראה, ממח העצם או מן הדם, ונבדלים בכמותם בהתאם
למיקרו-סביבה.
התוצאות בחולדות מתאימות לתוצאות בעכברים, מסיבות דומות, כנראה. הקינטיקה השונה של תוצאות המארקרים ED1 ו-ED2 תואמת אף היא מחקרים קודמים. בטחול העכברי הופיע מחדש MMM לפני MZM. למרות שתאי MMM הוםיעו מחדש לפני MZM בטחול החולדתי, לא ניתן היה להראות הבדלים חזקים דומים בקינטיקת ההופעה מחדש של התאים בחולדה.
ניתן להסיק כי נוכחותו או העדרו של מארקר מאקרופאגי זה או אחר אינם מבטיחים את נוכחותם או היעדרותם של התאים המתאימים לאותו מארקר. כמו כן מראות התוצאות כי הופעתה מחדש של אוכלסיית RPM בטחול החולדה מצריכה הגבה חיובית תוך-תאית ל-ED1 לפני התגובה ל-ED2. הופעתם מחדש של MZM בטחול העכברי מראה על פיתוח רצפטורים
לנוגדן המונוקלונאלי ERTR-9 לפני שהם רוכשים את יכולתם לעכל את החומר הפלורוסנטי.
היעדרותם של מאקרופאגים מן הכבד למשך שבוע לאחר הטיפול אפשרה את למידת התאים הללו. ביחס לטחול, מופיעים המאקרופאגים המגיבים ל-ED2 בכבד הרבה יותר מהר. קשה להסביר את הופעתם של תאים מסוג ED3+ ביום ה- 16 לאחר הטיפול באיברים בהם הם אינם נמצאים בדרך כלל, ויתכן שתופעה זו נובעת מתגובה חיסונית.
המתתם של תאי Kupffer בכבד של חולדות לאחר טיפול תוך-ורידי במספר תרופות הכלואות בליפוזומים נקבעה באמצעות מערך ניסוי המבוסס על מספר תאי Kupffer ליחידת שטח בחתכי כבד. גישה זו מאפשרת התבוננות מקרוב בפעילויות היחסיות של תרופות תוך-תאיות in vivo. עד המחקר נעשה שימוש ב-Clodronate כבתרופה היעילה ביותר להמתת
מאקרופאגים, כנראה משום הירידה במאגר התוך-תאי של ברזל, או בגלל יצירת אנאלוגים של ATP - מקור האנרגיה התאי. Propamidine יעיל פי 10 מ- Clodronat. Propamidine הוא חומר אנטי-מיקרוביאלי השיך למשפחת הפוליאמידינים הארומטיים, והוא נראה המתאים ביותר ליישומים ליפוזומליים, משום ששרשרת האלקיל הקצרה שלו מבטיחה
תכונות ליפוליטיות מינימליות, ולכן Propamidine לא יחצה את ממברנת הליפוזום ויביא להצטברות מקסימלית בתא הפאגוציטי. מנגנון הפעולה של Propamidine קשור אולי לעובדה שהוא מונע את פעילותם של פרוטאינזים רבים, אולם סביר יותר להניח כי יש קשר חזק יותר לפעילותם כקושרי DNA.
למרבה ההפתעה קשה היה למצוא ירידה חדה בפעילותם של תאי Kupffer בעקבות טיפול בליפוזומים המכילים EDTA בחולדות, וחשוב להבין את ההבדלים בין EDTA ל-Clodronate בלימוד תפקודם של תאי Kupffer.
התוצאות מראות כי האפופטוזיס הוא המנגנון העיקרי למות התאים הפאגוציטיים לאחר שעיכלו ליפוזומים הכולאים Propamidine או Clodronate. כרגע לא ניתן להסביר את תת-השיא של G1 לאחר מתן EDTA. מאחר שלא נתגלו סמני אפופטוזיס בניסויים אחרים עם תאי RAW 264 או עם מאקרופאגים צפקיים, יתכן כי האפופטוזיס אינה המנגנון
העקרי למות התאי המושרה בעקבות ליפוזמוי ה-EDTA. אי אפשר לשלול את ההשערה כי in vitro יכולים המאקרופאגים להתגבר על הנזק שגורם להם EDTA. העובדה כי ליפוזומים המכילים נחושת-EDTA השרו אפופטוזיס בתאי RAW 264 מצביעים על העובדה כי נחושת עשויה להיות מעורבת בהשריית אפופטוזיס, תוך כדי יצירת רדיקלים
הידרוקסיליים.
אי אפשר לפסול את האפשרות כי Propamidine ו-Clodronate חופשיים שדלפו מן הליפוזומים או מן המאקרופאגים המתים בתרבית התאים, לקחו גם הם חלק בנזק התאי, בניגוד למצב in vivo. העובדה כי גם Propamidine וגם Clodronate יכולים להשרות אפופטוזיס בתאים הפאגוציטיים מעניינת, מאחר ו-Clodronate היא תרופה אניונית, ואילו
Propamidine היא תרופה קטיונית, ולשתיהן מאפיינים שונים מאוד. לא ידוע כיצד Clodronate תוך-תאי משפיע על מטאבוליזם התא, אולם יתכן שמדובר, כאמור, בירידה במאגר הברזל התוך-תאי או ביצירת אנלוגים ל-ATP.
למרות שוקטורים של אדנו-וירוסים יעילים מאוד בהעברת DNA in vivo, הרי שביטוי הטרנסגן יורד בהתמדה לאורך זמן. בחלקו לפחות, הירידה בגנום הוקטורי נובע מהכרת אפיטופים ויראליים ו/או טרנסגניים על ידי המערכת החיסונית המסתגלת.
המחקר מתמקד בתפקידם של מערכות פאגוציטים מונו-נוקלארים בהגנת המארח כנגד וקטורים של אדנו-וירוסים ובתוצאות של אלימינציה של הפאגוציטים בתוך האיבר תוך העלאת יכולת הביטוי של טרנסגן הנישא על ידי הוקטור של האדנו-וירוס לתוך האיבר. התוצאות מצביעות על 90% העברה של הגנום הוקטורי לכבד, ומראות כי הירידה הזמנית
במאקרופאגים התאיים לפני הזרקת הוקטור, מביאות לעלייה משמעותית של הגנום הוקטורי המועבר לכבד, עלייה משמעותית בהתבטאות הטרנסגן, עלייה במשך קיומו של הגנום הוקטורי ועלייה במשך ביטוי הטרנסגן.
נראה כי מערכת החיסון המולדת משחקת תפקיד חשוב בהגנה כנגד Ads, וכי דיכוי מערכת זו מעלה את יעילות העברת הוקטור. יתכן כי העלייה ביעילות העברת הוקטור עלולה להוריד את כמות הוקטור הפנוי למערכת הפאגוציטים המונו-נוקלארית, ובכך להוריד את הנטל האנטיגני של המערכת החיסונית.
השגת מטרות וחידושים במחקר:
נראה כי המחקרים השיגו את מטרותיהם - המחקר הראשון בדק בהצלחה את ההבדלים בקינטיקות ההופעה מחדש של תתי-אוכלוסיות שונות של מאקרופאגים בכבד; המחקר השני התקדם והשווה את הממצאים העכבריים לממצאים דומים בחולדות; המחקר השלישי השווה בין השפעתם של חומרים שונים ממשפחות שונות על מנגנון ההתאבדות התאי בפאגוציטים;
המחקר הרביעי למד יותראת מנגנון ההתאבדות התאי עצמו של המאקרופאגים באמצעות ניסוי in vitro; המחקר האחרון בדק את יישומי השיטה, באמצעות הריגת תאי Kupffer להעברת מוצלחת יותר של וקטור של אדנו-וירוס המכיל את הטרנסגן CAT.
אין ספק כי עוד רבה הדרך למחקר וליישום התוצאות המחקריות עד שניתן יהיה להשתמש בתוצאות כמערכת מוצלחת לשיגור תרופות וליישום המתת המאקרופאגים במצבים פאתולוגיים שונים.
N. Van Rooijen, N. Kors, G. Kraal, 1989, "Macrophage Subset Repopulation in the Spleen: Differerntial Kinetics After Liposome-Mediated Elimination", j. Leukocyte Biol., 45, pp. 97-104.
N. Van Rooijen, N. Kors, M. V.d. Ende, C.D. Dijkstra, 1990, "Depletion and Repopulation of Macrophages in Spleen and aliver of Rat after Intravenous Treatment with Liposome-Encapsulated Dichloromethylene Diphosphonate", Cell Tissue Res, 260, pp. 215-222.
N. Van Rooijen, A. Sanders, 1996, "Kupffer Cell Depletion by Liposome-Delivered Drugs: Comperative Activity of Intracellular Clodronate, Propamidine, and Ethylenediaminetetraacetic Acid", Hepatology, 23, pp. 1239-1243.
N. Van Rooijen, A. Sanders, T.K. Van den Berg, 1996, "Apoptosis of Macrophages Induced by Liposome-Mediated Imtracellular Delivery of Clodronate and Propamidine", J. Immunol. Methods, 193, pp. 93-99.
G. Wolff, S. Worgall, N. Van Rooijen, W.R. Song, B.G. Harvey, R.G. Crystal, 1997, "Enhancement of In Vivo Adenovirus-Mediated Gene Transfer and Expression by Prior Depletion of Tissue Macrophages in the Target Organ", J. Virol., 71, pp. 624-629.

תגים:

קינטיקה · רפואה

אפשרויות משלוח:

ניתן לקבל ולהזמין עבודה זו באופן מיידי במאגר העבודות של יובנק. כל עבודה אקדמית בנושא "דיכוי זמני של תפקוד מאקרופאגים ע"י ליפוזומים המכילים תרופות (בטחול ובכבד של חולדות)", סמינריון אודות "דיכוי זמני של תפקוד מאקרופאגים ע"י ליפוזומים המכילים תרופות (בטחול ובכבד של חולדות)" או עבודת מחקר בנושא ניתנת להזמנה ולהורדה אוטומטית לאחר ביצוע התשלום.

אפשרויות תשלום:

ניתן לשלם עבור כל העבודות האקדמיות, סמינריונים, ועבודות המחקר בעזרת כרטיסי ויזה ומאסטרקרד 24 שעות ביממה.