השעון הביולוגי בפטריה נוירוספורה קראסה

תקציר העבודה:

השעון הביולוגי בפטריה נוירוספורה קראסה

תוכן עניינים hc1141

1. מבוא.
2. משתנה המצב .FRQ
3. גנים מבוקרי שעון.
4. דיון.
5. מקורות.

מבוא

קצביות (ריתמיות rhytmicity -) הינה היכולת לבצע פעולות ברצף מסודר ומחזורי,
המתואם לפי מעגל היום של אור וחושך. מקצבים מחזוריים נפוצים- ביותר וזוהו
במגוון רחב של אורגאניזמים פרוקריוטים פוטוסינטטים ואוקריוטים -
מאורגאניזמים חד-תאיים ועד ליונקים. מקצבים אלה חיוניים לויסות זמן תקין
של תופעות רבות, החל מגדילת חידקים והתרבות אצות, דרך פוטוסינתיזה ותנועת
עלים בצמחים, מחזורי התרבות שנתיים בצמחים ובבעלי-חיים, ועד למחזורי שינה
ועירות באדם. כדי לקיים מקצבים יומיים, האבולוציה ציידה את התאים בשעונים
ביולוגיים פנימיים. קל לצפות בתהליכים המבוקרים על-ידי השעונים הביולוגיים,
אולם המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס השעונים הללו החלו להחשף רק
בשנים האחרונות.
השעון הביולוגי נקרא גם "מתנד" (oscillator), מפני שהוא תכונה הנובעת
מהתנודדות מחזורית ברמות חומרים ופעילויות בתא. קיימות שתי אסכולות לגבי
מהותם של שעונים ביולוגיים. הגישה הראשונה גורסת, שהשעון הביולוגי הינו
תכונה גלויה של פעילויות משק התא, שיש להן רשתות בקרה המתנודדות באופן
ספונטאני. בהתאם למודל זה לא קיימים מולקולות או תהליכים בודדים,
שחיוניים באופן יחודי לתפקוד השעון. הגישה השניה גורסת, שהשעון מורכב
ממרכיבים מיוחדים לו (אחד או יותר), שתפקידם העיקרי הוא יצירת הסיגנל
המחזורי. אובדן המרכיבים הללו ישבש רק את פעולת השעון, ללא פגיעה
בתפקודים תאיים אחרים. במקרה זה ניתן להשתמש במושגים "מולקולות שעון"
ו"גנים של שעון". רוב ההתקדמות בהבנת הבסיס המולקולרי של השעון הושגה על
בסיס מודלים, שמניחים את קיומן של מולקולות מיוחדות של שעון.

מקורות:

1. מבוא.
2. משתנה המצב FRQ.
3. גנים מבוקרי שעון.
4. דיון.
5. מקורות.
1. מבוא
קצביות (ריתמיות - rhytmicity) הינה היכולת לבצע פעולות ברצף מסודר ומחזורי, המתואם לפי מעגל היום של אור וחושך. מקצבים מחזוריים נפוצים- ביותר וזוהו במגוון רחב של אורגאניזמים פרוקריוטים פוטוסינטטים ואוקריוטים - מאורגאניזמים חד-תאיים ועד ליונקים. מקצבים אלה חיוניים לויסות זמן תקין של תופעות רבות, החל
מגדילת חידקים והתרבות אצות, דרך פוטוסינתיזה ותנועת עלים בצמחים, מחזורי התרבות שנתיים בצמחים ובבעלי-חיים, ועד למחזורי שינה ועירות באדם (4, 5, 8). כדי לקיים מקצבים יומיים, האבולוציה ציידה את התאים בשעונים ביולוגיים פנימיים. קל לצפות בתהליכים המבוקרים על-ידי השעונים הביולוגיים, אולם המנגנונים
המולקולריים העומדים בבסיס השעונים הללו החלו להחשף רק בשנים האחרונות.
השעונים הביולוגיים, המווסתים מקצבים יומיים, נקראים גם "שעונים מחזוריים" (circadian clocks). בתנאים רגילים הם מותאמים למעגל החושך והאור ביממה, אולם בתנאים סביבתיים קבועים (למשל, בתנאי חושך קבועים) הם פועלים באופן חופשי, עם תקופת מחזור שאורכה קרוב, אך לא זהה, לאורך יממה (8). למקרים כאלה הוגדר המושג
"זמן מחזורי" (circadian time = CT). הזמן המחזורי מתקבל על-ידי חלוקה של תקופת המחזור של השעון ב- 24 שעות מחזוריות. לכן באורגניזם, שמחזור השעון החופשי שלו נמשך 23 שעות, שעה מחזורית תהיה שווה לכ- 57.5 דקות בזמן האמיתי. בתנאי חושך קבועים הזמן המחזורי מגדיר את תחושת הזמן הסוביקטיבית של האורגניזם: CT0
הוא זמן הזריחה הסוביקטיבי, CT12 הוא זמן השקיעה הסוביקטיבי ו- CT18 מקביל לאמצע הלילה (9). הכושר לשמור על תקופת מחזור אנדוגנית קבועה, שאורכה קרוב מאוד ל- 24 שעות, בנוכחות תנאים סביבתיים משתנים (כמו שינויי טמפרטורה), מתאפשר בזכותם של מנגנוני פיצוי (compensation) (3). ניתן לשנות את פאזת השעון ו"לאתחל"
אותו (reset) על-ידי אותות סביבתיים כמו אור (5).
השעון הביולוגי נקרא גם "מתנד" (oscillator), מפני שהוא תכונה הנובעת מהתנודדות מחזורית ברמות חומרים ופעילויות בתא. קיימות שתי אסכולות לגבי מהותם של שעונים ביולוגיים. הגישה הראשונה גורסת, שהשעון הביולוגי הינו תכונה גלויה של פעילויות משק התא, שיש להן רשתות בקרה המתנודדות באופן ספונטאני. בהתאם למודל זה
לא קיימים מולקולות או תהליכים בודדים, שחיוניים באופן יחודי לתפקוד השעון. הגישה השניה גורסת, שהשעון מורכב ממרכיבים מיוחדים לו (אחד או יותר), שתפקידם העיקרי הוא יצירת הסיגנל המחזורי. אובדן המרכיבים הללו ישבש רק את פעולת השעון, ללא פגיעה בתפקודים תאיים אחרים. במקרה זה ניתן להשתמש במושגים "מולקולות
שעון" ו"גנים של שעון". רוב ההתקדמות בהבנת הבסיס המולקולרי של השעון הושגה על בסיס מודלים, שמניחים את קיומן של מולקולות מיוחדות של שעון (8).
כפי שמתואר בתמונה 1 (10), השעון הביולוגי הינו לולאת משוב שלילי, שבה מרכיבים מסוימים פועלים כ"משתני מצב" (state variables - בתמונה: D-A), ומרכיבים אחרים פועלים כפרמטרים מתווכים (בתמונה: a-d). את הדגם משלימים מסלולי קלט אל הלולאה ומסלולי פלט מן הלולאה. מסלולי הפלט מכילים בקרת שעון על התבטאותם של גנים
או חלבוני מטרה מסוימים, כנראה באמצעות מסלולי העברת סיגנל (signal transduction pathways) שמתחילים במתנד המחזורי. משתנה מצב הינו מרכיב מרכזי בשעון, שהשינוי המחזורי בכמותו או בפעילותו בתא חיוני לתפקוד הנורמלי של המתנד (7). למעשה משתנה המצב הוא המרכיב, שמגדיר את הזמן המחזורי בשעון. על מנת להגדיר מולקולה
מסוימת כמשתנה מצב בשעון הביולוגי, עליה למלא אחר הדרישות הבאות (4, 10):
הכמות או הפעילות של המולקולה צריכה להתנודד במהלך התקופה המחזורית.
התנודדות מחזורית בכמות המולקולה או בפעילותה דרושה להתגלות הפנוטיפ הקיצבי ומתאימה למיקצב הגלוי. כלומר, ביטוי קבוע ויציב של המולקולה חייב לבטל את ההתבטאות הפנוטיפית של המיקצב המחזורי.
לפעילות המולקולה יש השפעת משוב על הפעילות או הכמות שלה עצמה;
שינויים פתאומיים בפעילות או בכמות של מולקולה זו גורמים לאיתחול מחדש (reset) או להזזה (shift) של פאזת השעון.
חקר הבסיס המולקולרי והתאי של מערכות מחזוריות מתרכז בשלוש שאלות כלליות בולטות (7):
מהו הבסיס הביוכימי והמולקולרי של המתנד ?
כיצד מועבר מידע הזמן, הנוצר על-ידי השעון, בתוך התא כדי לבקר בו תהליכים שונים ?
כיצד משפיעים אותות הזמן ("zeitgebers") מהעולם החיצוני על כוונון השעון, ומתאימים את המיקצב התאי למעגלי היום והחושך ?
אחת הגישות המחקריות המצליחות לזיהוי מרכיבי השעון היתה אנאליזה על-ידי מוטציות, בעזרתה זוהו אתרים גנטיים, שתוצרי התבטאותם משתתפים במנגנון המרכזי של השעון הביולוגי. בשנות ה- 70 המוקדמות התגלו האתרים הגנטיים per (period) ב- Drosophila melanogaster ו- frq (frequence) ב- Neurospora crassa. מוטציות ב-
per או ב- frq ביטלו את התבטאות המיקצב או שינו את אורך המחזור שלו. בעשור האחרון גויסו שיטות מתקדמות בגנטיקה מולקולרית לחקר הגנים per ו- frq ותפקידם ביצור מקצבים מחזוריים, ונראה שגנים אלה הינם משתני מצב של השעון הביולוגי (10).
מבין האורגניזמים האוקאריוטים, נוח לעקוב אחר ביטוי השעון הביולוגי בפטריה נוירוספורה-קראסה (Neurospora crassa), שבה השעון הפנימי מבקר מחזור גלוי ומבוטא בבירור של התפתחות ומורפולוגיה. הנוירוספורה-קראסה יכולה להתרבות בשתי צורות בלתי-מיניות, המתחלפות באופן מחזורי: יצירת תאי תפטיר (mycelium) בלתי
ממוינים; ויצירת קורים עדינים, הנושאים נבגים (spores) כתומים בשם conidia, בתהליך הנקרא קונידיאציה (conidiation). בזן הבר של נוירוספורה-קראסה מתרחשת קונידיאציה אחת ל- 21.5 שעות בתנאי חשיכה קבועים. העברת התרבית מאור לחושך קבוע גורמת לאיתחול השעון (reset) ולסינכרוניזציה, כך שכל התאים שהועברו לחושך
באותו זמן, נמצאים באותה פאזת זמן סוביקטיבי. תהליך הקונידיאציה, שנחקר היטב וקל לניטור; גודל הגנום הקטן; הזמינות של אללים מוטאנטים של הגן frq, שהינו מרכיב חיוני במנגנון השעון; והיכולת לשלוט על כוון השעון ולגרום לסינכרוניזציה של השעונים בתרבית על-ידי אור, טמפרטורה ותרופות, הפכו את הנוירוספורה-קראסה
לאורגאניזם אידיאלי לחקר המנגנון של השעון המחזורי(5, 6).
בעבודה זו אסקור חלק מההתפתחויות שחלו בשנים האחרונות בחקר השעון הביולוגי בפטריית הנוירוספורה קראסה, ואתרכז ביחוד באתרים הגנטיים frq, ccg-2 , ccg-1. העבודה מתרכזת במספר מאמרים, המייצגים את ההתקדמות במציאת תשובות לשלוש השאלות המרכזיות שפורטו לעיל.
2. משתנה המצב FRQ
כיום ידועים 14 זני נוירוספורה-קראסה בעלי שעון מחזורי מוטאנטי. בשמונה זנים מהם התגלתה מוטציה בודדת באתר frq (frequence) בגנום, שמקודד ככל הנראה למרכיב מרכזי בשעון. מוטציה באתר זה יכולה לגרום להארכה או לקיצור של תקופת המחזור של השעון, ואף לאובדן מוחלט של הקצביות בתנאי חשיכה קבועים (מוטציה סתמית,
null, המבטלת את פעילות הגן). מוטציה כזו יכולה לגרום גם לאובדן חלקי או שלם של יכולת הפיצוי של השעון בתנאי טמפרטורה או הזנה שונים. באמצעות שיבוט הגן frq מצאו, שהוא מכיל מסגרת קריאה פתוחה ארוכה (ORF = open reafing frame), המקודדת לחלבון בן 989 חומצות אמיניות, FRQ. כל המוטציות של frq בזנים בעלי השעון
המוטאנטי מופו למסגרת הקריאה הפתוחה הזו. מוטציה מסוג הזזת מסגרת (frameshift) בתוך ה- ORF או הסרת ה- ORF מהאתר frq גורמות לאובדן מוחלט של הקצביות היציבה בתנאי חשיכה קבועים ושל הפיצוי כנגד שינויי טמפרטורה. בתמונה 2 מפורטים רצף חומצות האמינו של FRQ, ומיקום המוטציות השונות של frq לאורך מסגרת הקריאה
הפתוחה (5).
על מנת לבדוק אם FRQ הינו משתנה מצב בשעון הביולוגי של נוירוספורה-קראסה, יש לברר בין השאר אם ל- FRQ יש יכולת בקרה עצמית על יצור FRQ נוסף, ואם חלבון זה מגדיר את הזמן המחזורי בשעון. במאמר אלגנטי ביותר דונלאפ ושותפיו (4) הוכיחו, שהתוצר המשוער של הגן frq מבקר את קצב השיעתוק של הגן frq , וממלא אחר כל שאר
הקריטריונים המגדירים משתנה מצב של השעון הביולוגי (הקריטריונים מפורטים במבוא):
התבטאותו של frq mRNA נמדדה בעזרת Northern blotting ברווחים של 4 שעות, בתנאי חשיכה יציבים, במשך 48 שעות לפחות. כמות ה- frq mRNA לא היתה קבועה, אלא התנודדה באופן מחזורי לפי אורך המחזור של השעון. בפטריה מזן-הבר (frq+) רמות ה- frq mRNA היו מירביות בזמנים 12-16 ו- 32-36 שעות לאחר ההעברה לחושך. בתרגום
לערכי זמן מחזורי (CT), כמות ה- frq mRNA מירבית ב- CT 0-5, זמן המייצג את הבוקר הסוביקטיבי. רמות ה- frq mRNA היו מזעריות בזמנים 0-4 ו- 24-28 שעות לאחר ההעברה לחושך (ערב סוביקטיבי). אורכה של תקופת המחזור של מיקצב ה- frq mRNA היה 22 שעות, כאורכו של מחזור הקונידיאציה בפטריה (תמונה 3A).
התבטאותו של frq mRNA נבדקה גם בזן frq7 של נוירוספורה-קראסה, בעל מוטציה נקודתית בגן frq ותקופת מחזור של 29 שעות, וגם בו נצפתה התנודדות מחזורית בכמות ה- frq mRNA, שאורך מחזורה היה זהה לאורכו של מחזור הקונידיאציה (תמונה B3). אם FRQ דרוש להתגלות הפנוטיפ הקצבי, אז מוטציות המבטלות את התנודות המחזוריות
ברמת frq mRNA יגרמו לביטול המקצביות הנורמלית. frq9 הינו זן של נוירוספורה-קראסה, הנושא מוטציה של הזזת מסגרת (frameshift) באתר frq, ובו המיקצב המחזורי נעלם לחלוטין והקונידיאציה פוחתת. כשנמדדה רמת ה- frq mRNA לאורך הזמן בזן זה, התברר שהרמה אינה קבועה ועדיין מתנודדת, אולם לא באופן מחזורי. בנוסף, כמות
ה- frq mRNA בזן זה היתה גדולה פי 2-3 מכמותו בתאי זן הבר (תמונה B3).
כדי לברר אם אכן התבטאות המיקצב המחזורי של הקונידיאציה בתאים תלויה בהתנודדות המחזורית של רמות ה- frq mRNA ולא רק בעצם התבטאות הגן, הכינו החוקרים תכשיר מאוחה של מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) frq עם הפרומוטר qa-2. qa-2 הינו פרומוטר של נוירוספורה-קראסה, הגורם לשיעתוק הגן שאחריו בנוכחות המשרן (inducer)
חומצה קינית (quinic acid). התכשיר המאוחה הוחדר לתאים מזן frq+ (זן הבר), במטרה לגרום להתבטאות ממושכת וקבועה של frq בנוכחות חומצה קינית. תאי frq+ , שעברו טרנספורמציה עם התכשיר המאוחה, הציגו פנוטיפ קצבי נורמלי בהעדר המשרן. לעומת זאת, בנוכחות חומצה קינית התבטל מיקצב הקונידיאציה (תמונה 4).
העובדה, שכמות ה- frq mRNA בתאים שבהם אין FRQ פעיל (frq9) גדולה מכמות ה- frq mRNA בתאי זן הבר, רומזת שאולי FRQ מפעיל, ישירות או בעקיפין, משוב שלילי על שיעתוק הגן המקודד לו, וכך מעכב יצור frq mRNA נוסף. גם העובדה, שמוטציות ב- frq גורמות לשנוי אורך המחזור, מתאימה להיפותזה ש-FRQ יוצר לולאת משוב באורך
תקופה של כיממה. אם FRQ אכן מפעיל משוב שלילי על שיעתוק frq, אז ביטוי ה- frq האקסוגני בהשראת החומצה הקינית צריך לגרום לדיכוי התבטאותו של frq האנדוגני, ואכן תופעה זו נצפתה בבירור (תמונה 5).
תרביות מזן הבר, שחלקן נשאו את המבנה המאוחה וחלקן לא נשאו אותו, הועברו מאור לחשיכה קבועה במועדים שונים, כך שבכל תרבית פאזת השעון היתה שונה. בשלב זה הוסף המשרן לכל התרביות. אם רמת ה- frq mRNA בתא מגדירה את פאזת השעון, אז הסרת המשרן צריכה לגרום לכל התרביות נושאות התכשיר המאוחה להתחיל את המיקצב מפאזה
זהה ולהמשיך להתנודד באופן סינכרוני. זאת משום שהסרת המשרן גורמת לרמת frq mRNA לרדת באופן פתאומי. בניסוי עצמו, לאחר שהחומצה הקינית נשטפה מהתרבית, התאים שהוחדר להם התכשיר המאוחה עברו כוונון מחדש (reset) של השעון, ומחזור הקונידיאציה החל בהם מחדש בו-זמנית. תאי frq+ , שלא עברו טרנספורמציה עם התכשיר
המאוחה, לא עברו כוונון מחדש בעקבות הסרת החומצה הקינית או סינכרוניזציה, והמשיכו להתנודד בפאזות נפרדות, לפי המועדים שבהם הועברו מאור לחושך (תמונה 6).
הניסויים שתוארו לעיל נערכו בחשיכה קבועה, כאשר התאים מבטאים את המיקצב הפנימי שלהם. אורכו של המחזור האנדוגני קרוב, אך לא שווה בדיוק, לאורך יממה. למרות זאת, במציאות השעונים הביולוגיים בתאים מושפעים מחילופי חושך-אור ומתואמים עם הזמן האמיתי בסביבה החיצונית.
מספר מחקרים תארו את התגובות לאור של מערכות מחזוריות באורגאניזמים שונים, והמסקנות הבאות הוסקו במידה שווה לגבי כל האורגאניזמים כמעט (מסוכם במקור 7):
השעון הביולוגי רגיש לאור.
המשרעת והכוון של תגובת השעון לאור (התקדמות או עיכוב) משקפים את הזמן האוביקטיבי ביום. גרויי אור קצרים זהים גורמים לקידום השעון (זרוז הקונידיאציה), כשהם נראים בשעות הלילה המאוחרות או בשעות הבוקר המוקדמות, וגורמים להשהיית השעון (והקונידיאציה) בשעות היום המאוחרות או בשעות הערב המוקדמות.
בעקבות גרוי אור פתאומי השעון עצמו מאותחל מחדש (reset) מהר מאוד, תוך דקות עד שעות, אפילו אם חולפים ימים עד שנראה שינוי פנוטיפי. בניסויי גרוי כפול (two-pulse), שבהם השעון המחזורי נחשף תוך זמן קצר לשתי פעימות אור עוקבות, הראו שהשעון המחזורי בנוירוספורה-קראסה מאותחל תוך 15 דקות לאחר גרוי אור בן 90
שניות בחשיכה קבועה.
אור נראה הוא אות הזמן הדומיננטי והאוניברסאלי בכל המערכות המחזוריות, למרות שקיימים גורמים נוספים המשפיעים על כוונון השעון המחזורי (כולל טמפרטורה, תזונה ואותות חברתיים). אסקין ושותפיו הציעו כבר בשנת 1979 מודל, המסביר כיצד מועבר מידע האור לשעון: יתכן שהאור גורם לשפעול של פוטורצפטור וכתוצאה מכך נוצרים
אותות תוך-תאיים, הגורמים (בתום מסלול להעברת סיגנל) לשינוי ברמתו או בפעילותו של משתנה המצב של השעון. לפי מודל זה, הארועים הביוכימיים ההתחלתיים, שמעורבים בקליטת האור, אינם יחודיים לשעון, ורק הארועים המאוחרים יותר ספציפים לשעון (מסוכם במקור 7). אם כך נשאלת השאלה, מהו הארוע המולקולרי המוקדם ביותר
הספציפי לשעון בתהליך האיתחול מחדש על-ידי אור? מודל הטעינה בלתי פרמטרית של Pittendrigh מניח, שהאור גורם לשינוי פתאומי ולא הדרגתי בפאזת השעון. הזמן ביום, הנמסר על-יד השעון, הינו פרשנות ספציפית של אות האור הפשוט. למרות שמודל זה לא הוכח באופן חד-משמעי, הוא זכה להצלחה כלל-עולמית. ממודל זה נגזרת הנחה
שניתנת לבדיקה, שהארוע המוקדם ביותר הספציפי לשעון בתהליך האיתחול בהשראת אור הינו שינוי מהיר וניכר ברמת הפעילות של משתנה המצב של השעון.

כדי להבין כיצד משפיע אור על כוונון השעון הביולוגי, דונלאפ ושותפיו בדקו (7) את השפעתם של גרויי אור קצרים על התבטאות הגן frq, שזוהה כמקודד למשתנה המצב (החלבון FRQ) בשעון הביולוגי של נוירוספורה-קראסה. התבטאותו של frq mRNA בתגובה לאור נבדקה בתרביות נוירוספורה-קראסה, שגודלו בתנאי חושך קבועים במשך 32
שעות (CT1 - בוקר סוביקטיבי) עד 44 שעות (CT13 - זמן שקיעה סוביקטיבי), ואז נחשפו לאור נראה במשך 2 דקות. החשיפה לאור גרמה לעליה גדולה ברמת ה- frq mRNA בתאים (פי 4-25), שהחלה במשך 2 דקות החשיפה ונמשכה 15 דקות נוספות (תמונה A7). חשיפת התרביות להקרנת אור ממושכת או לפעימת אור קצרה בת 2 דקות הניבה תוצאות
דומות. דבר זה רומז, שהמעבר הפתאומי מחושך לאור ולא עצם ההארה עצמה, הוא שגרם לשיעתוק מוגבר של frq.
בעקבות החשיפה לאור נצפה סף של כמות פוטונים (8 מיקרומול פוטונים למטר), שמתחתיו לא ניצפו שינויים בפאזת השעון או בהתבטאות frq. מידת השינוי (shift) בפאזת השעון כתוצאה מהחשיפה לאור (בעוצמה גדולה מהסף) מתאימה היטב למידת העליה בכמות ה- frq mRNA בתאים (תמונה 8). תרופות שחוסמות סינתיזת חלבונים
(5-azacytidine לא מונעת סינתיזת mRNA, אך הופכת אותו לבלתי ניתן לתרגום), ולכן חוסמות את תרגום frq mRNA לחלבון FRQ, מונעות את השינוי הפנוטיפי בפאזת השעון בהשראת אור (האיתחול), למרות שלא נמנעת העליה בכמות frq mRNA (תמונה 9). תוצאות אלה מתאימות להיפותזה, שהשראת שיעתוק מוגבר של frq בעקבות חשיפה לאור,
היא הארוע הספציפי לשעון והמוקדם ביותר, העומד בבסיס השינוי הפנוטיפי במיקצב (7).
ידוע שאותות אור זהים מתפרשים באופן שונה על-ידי השעון המחזורי בזמנים סוביקטיבים שונים ביום, כך שבשעות הערב המוקדמות הם גורמים להשהיית המקצב המחזורי, ובשעות הלילה המאוחרות הם גורמים לקידומו. לעומת זאת, כפי שניתן לראות בתמונה B7 (7), האור השפיע באופן חד-כוונית בלבד על frq: בכל זמן מחזורי, שהתאים נחשפו
בו להקרנה קצרה באור נראה, הושרתה עליה דומה בהתבטאות frq (שינוי דומה מבחינה סטטיסטית במשרעת ובכוון). לכן ההבדלים בתגובה לאור בזמנים שונים ביממה חייבים לנבוע משינויים בלולאות המשוב, המתווכות בין העליה בשיעתוק frq לבין הפנוטיפ המיקצבי, בשעות היום השונות. הפרשנות השונה של גרויים זהים על-ידי השעון בתנאים
סביבתיים שונים, הגורמת לכך שגרוי אור זהה יכול לגרום להשפעות שונות בזמנים שונים ביום, ניתנת לביטוי גראפי באמצעות עקומת פאזה-תגובה (RPC = phase-response curve). בעקומה זו מתואר הקידום או ההשהיה של השעון בעקבות גרוי אור קצר וסטנדרטי, כפונקציה של פאזת השעון המחזורי. בתמונה 10 מתוארת עקומת PRC של
נוירוספורה-קראסה ביחס למחזור היומי האנדוגני של רמת ה- frq mRNA בפטריה בתנאי חשיכה קבועים. מסתבר, שמבחינת השפעתו של האור על השעון, ישנם שני שלבים במשך היום (7):
בשעות הלילה המאוחרות ובשעות הבוקר המוקדמות האור גורם לקידום המקצב. בשעות אלה התבטאות frq נמצאת במגמת עליה. כנראה שאות האור גורם לעליה מהירה יותר ברמת frq mRNA יחסית לתנאי חושך קבועים, וכתוצאה מכך השיא ברמות frq mRNA ו- FRQ מושג מהר יותר.
בשעות היום ובערב המוקדם האור גורם לתגובת השהיה של המקצב. בשעות אלה התבטאות frq נמצאת במגמת ירידה. כנראה שהעליה בשיעתוק frq בהשראתו של גרוי האור גורמת לעליה בתכולת ה- frq mRNA בתא, ומאריכה את הזמן הדרוש להשגת רמות השפל של frq mRNA ו- FRQ.
קיים קטע קצר במרכז העקומות, שבו אור עדיין גורם לקידום קל של המקצב, למרות שרמת frq mRNA כבר הגיעה לשיא והתחילה לרדת. סביר להניח, שרמת FRQ מירבית מושגת זמן קצר לאחר השיא ברמת frq mRNA.
חסרונו העיקרי של מודל זה נובע מפיתוחו על סמך ניסויים בתאים, שגודלו בחושך קבוע ונחשפו לאותות אור קצרים בני שתי דקות, המחקים זריחה ושקיעה. לעומת זאת במציאות התאים חשופים לתקופות ממושכות ומתחלפות לסרוגין של אור וחושך. מכיון ש- FRQ מפעיל משוב שלילי על התבטאות הגן המקודד לו frq (4), אין זה ברור אם גם
בתנאי הארה ממושכים נגרמת עליה משמעותית ברמת frq mRNA בתאים. על מנת לבדוק סוגיה זו נמדדו רמות frq mRNA בתאי פטריה, שנחשפו לאור בהיר וקבוע במשך עד 36 שעות (7). כמות ה- frq mRNA עלתה ונותרה גבוהה (יחסית לתאים שגודלו בחושך) במשך כל תקופת ההארה (תמונה A11). עליה ממושכת בהתבטאות frq קיימת גם בזן הפטריה
frq9 (שלא יוצר FRQ, ולכן חסר את המשוב השלילי על התבטאות frq) ובזן שמבטא frq mRNA בהשראת חומצה קינית (בגלל פרומוטר qa-2). במקרה השני, הסרת המשרן חומצה קינית גורמת לירידה פתאומית ברמת frq mRNA בתא ולהסטת המיקצב המחזורי (reset) לזמן של שקיעה סוביקטיבית (4). תופעה דומה נצפתה גם בעקבות העברת תרביות,
שהוארו באור ממושך, לחושך (תמונה B11) (7).
כיצד מתפתחות רמות גבוהות של frq mRNA במשך כל תקופת ההארה בתאים המוארים באופן ממושך, למרות נוכחותם של רכוזים גבוהים של החלבון FRQ, האמורים לדכא את יצורו של frq mRNA? גרוי האור חייב להתגבר על הבקרה העצמית השלילית של FRQ - באמצעות הקלת ההשפעה המדכאת של FRQ על שיעתוק frq , או על-ידי השראה ישירה של יצור
frq mRNA נוסף למרות נוכחות FRQ. מסתבר שגם בזן הפטריה frq9 , שאינו מייצר FRQ בגלל מוטציית הזזת מסגרת בתוך מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של frq, אור משרה עליה ברמת ה- frq mRNA (תמונה 12) (7). בפטריות שהוחדר להן תכשיר גנטי, שהכיל את הגן frq מורכב עם הפרומוטר qa-2, חומצה קינית הישרתה ביטוי frq מהתכשיר,
בכמות מספקת לדיכוי היצור של frq mRNA אנדוגני (4). גם בתאים אלה אור, אפילו בנוכחות חומצה קינית, הישרה יצור frq mRNA מוגבר (תמונה 13) (7). תוצאות אלה רומזת, שהאור משרה ישירות יצור frq mRNA נוסף למרות נוכחות FRQ, ולא רק מפחית את ההשפעה המעכבת של FRQ על השיעתוק.
3. גנים מבוקרי שעון

frq הוא גן המתבטא באופן ספציפי בבוקר הסוביקטיבי (4). כדי לבודד גנים, שהתבטאותם מבוקרת על-ידי השעון בנוירוספורה קראסה, דונלאפ ושותפיו (9) סקרו ספריות DNA גנומי וספריות cDNA, ובודדו גנים שהתבטאותם ספציפית לשעות הבוקר המוקדמות (CT1 - בזן הבר, לאחר 23 שעות בחושך) או לשעות הערב המוקדמות CT13) - בזן
הבר, לאחר 34 שעות בחושך). ספריות ה- DNA הופקו משני זנים של נוירוספורה קראסה, שגודלו בתנאי חושך קבועים ובמצע דל: זן הבר - בעל מחזור בן 21.5 שעות, והזן frq7 - בעל מחזור בן 29 שעות בטמפרטורה 25°C. ספריית ה- cDNA יוצרה כהעתק של mRNA בלבד (polyadenylated RNA) בעזרת גלאים (probes) משלימים. הגנים
הספציפים לזמן זוהו בעזרת היברידיזצית החסרה (subtractive hybridization): עודף גדול של polyadenylated RNA, שהופק מתאים בפאזת השעון CT13, הועבר היברידיזציה עם cDNA, שהופק מתאים בפאזת השעון CT1, ולהיפך. cDNAs של גנים המתבטאים בשתי פאזות השעון הוסרו, וה- cDNAs שנותרו לאחר ההחסרה מייצגים את ה- mRNAs
הספציפים לזמן. בעזרת שיטה זו ניתן לזהות גנים המבוקרים על-ידי ההתפתחות (למשל, גנים שהתבטאותם נובעת מההפרעה לקונידיאציה); גנים שהתבטאותם נובעת מתגובה לסביבה (למשל, בתגובה להרעבה); וגנים המבוקרים על-ידי השעון המחזורי. כדי לבודד גנים מבוקרי שעון, נערכה השוואה בין שני זני הפטריה (זן הבר ו- frq7): שני
הזנים גודלו בחושך במשך יומיים, ובכל 4 שעות הופרד מהם כל ה- RNA התאי ליצור ספריית cDNA. במשך תקופה זו התאים מזן הבר משלימים 2.5 מחזורים, ואילו תאי frq7 משלימים פחות מ- 2 מחזורים שלמים. cDNAs שנותרו לאחר היברידיזציית ההחסרה, ומקודדים לגנים שהתבטאותם משתנה בקצב שונה בשני זני הפטריה (בהתאם לתקופות
המחזור השונות), הוגדרו כמייצגים גנים שהתבטאותם מבוקרת על-ידי השעון הביולוגי. בעזרת פרוטוקול זה זוהו רק שני גנים ספציפיים לבוקר, שהתבטאותם מתנודדת לפי אורך המחזור: 0, ccg -1 (ccg = clock controlled gene) (תמונה 14). מיפוי גנטי בעזרת אנזימי רסטריקציה (שיטת RFLP) הראה ששני הגנים נפרדים, ואינם נמצאים
בתאחיזה גנטית. הגן ccg-1 משועתק ל- mRNA בעל כ- 600 נוקלאוטידים. ריכוז ה- ccg-1 mRNA עולה מיד לאחר הזריחה הסוביקטיבית (CT2) (9). ידוע שהתבטאותו של ccg-1 מושרית על-ידי אור ומדוכאת על-ידי גלוקוז (3).ccg-2 mRNA מכיל כ- 800 נוקלאוטידים, וריכוזו המירבי בתא מושג בזמן מוקדם יותר, משעות הלילה המאוחרות ועד
לשעות הבוקר המוקדמות הסוביקטיביות (בין CT18 ל- CT2). לא זוהו גנים מבוקרי שעון ספציפים לערב (9).
כדי לבדוק אם ההתבטאות המקצבית של ccg-1 נובעת מבקרה של השעון הביולוגי על שיעתוקו, אראפיה ושותפיו (1, 3) חקרו את הבקרה המסובכת על התבטאות הגן הזה. אין ספק ש- ccg-1 נתון לבקרת השעון המחזורי. בזן frq9 )בעל מוטציה סתמית בגן frq), שחסר פעילות שעון, אובדת הבקרה המחזורית על התבטאות ccg-1 בתנאי חשיכה
קבועים. עם זאת התבטאות ccg-1 גם בזן זה עדיין בלתי יציבה, אלא מתנודדת באופן בלתי סדיר, בהתאם לשינויים בפוטנציאל ההתפתחותי (תמונה 15). חשיפה לאור גורמת לעליה בהתבטאות ccg-1, אולם מסתבר שתוצאה זו אינה תלויה בפעילות השעון המחזורי! שני זנים של נוירוספורה-קראסה, זן הבר בעל שעון מתפקד והזן frq9, גודלו
במשך 18-24 שעות בחושך ואז הוארו באופן ממושך. בשני הזנים, גם בזן שחסר שעון מתפקד, האור הישרה התבטאות של ccg-1 (השווה תמונות 16 ו- 17). העליה בהתבטאות ccg-1 בהשראת אור תלויה בנוכחותם של תוצרי הגנים wc-1, wc-2 (wc = white collar). גנים אלה ידועים כבעלי תפקיד מרכזי בכל התגובות של נוירוספורה-קראסה לאור
(1, 3).
לורוס ושותפיה (6‏‏‏‏‏‏) חקרו את הגן ccg-2 , ומצאו שהוא מכיל יחידת שיעתוק אחת, וגודלו 1900 זוגות בסיסים (1.9 kb). הם הישוו בין הרצפים של הגן הגנומי וה- cDNA, ומצאו שהגן מכיל אינטרון (intron) בן 94 נוקלאוטידים, שמוסר מה- mRNA הבוגר. כך ה- mRNA הבוגר וה- cDNA ששובט ממנו מכילים 776 נוקלאוטידים (תמונה
18). הגן מקודד לפוליפפטיד בן 109 חומצות אמינו, שמשקלו המולקולרי 11,000 דלטון. 45% מהחומצות האמיניות ב- Ccg-2 הינן חומצות אמינו הידרופוביות (A, F, I, L, M, P, V), והחלבון מציג תכונות הידרופוביות חזקות. האתרים ההידרופובים העיקריים בחלבון נמצאים בקצה האמיני שלו ובמרכזו. ‏‏‏בנוסף, החלבון מכיל מספר גבוה
במידה בלתי רגילה של שיירי ציסטאין, מספר אתרים פוטנציאליים לזרחון על-ידי casein kinase 2 ופרוטאין קינאז C, ו- 3 אתרי מיריזטילציה חופפים (6).
מסתבר שהחלבון Ccg-2 חולק דמיון גדול ברצף עם מספר חלבוני פטריות אחרים, שאף הם הידרופובים, בעלי משקל מולקולרי נמוך ועשירים בציסטאין (מתוכם 8 ציסטאינים שמורים). חלבונים אלה נמצאים בדופן של תאי פטריה ואחראים לתכונות ההידרופוביות שלה. בתמונה 19 מושווים תוצרי הגנים ההידרופובונים sc3 מ- Schizophyllum
commune ו- rodA (rodletless) מ- Aspergillus nidulans עם Ccg-2. בין שלושת החלבונים נמצאה זהות של 16%. גם מיקום האינטרון ב- Ccg-2 ומיקום האינטרונים בקצה '3 של sc3 ו- rodA היו זהים. יתכן שכל שלוש הגנים התפתחו מגן-אב משותף (6).
אינאקטיבציה ישירה של האתר rodA ב- Aspergillus nidulans גורמת לאובדן הצרורות המקבילים של מעין "מקלות" קצרים (rodlets), הנמצאים באופן רגיל על פני השטח החיצוני של הנבגים (conidia). גם בנוירוספורה-קראסה זוהה זן מוטאנטי, הנושא את האלל eas (easily wettable), עם שינוי פנוטיפי דומה. הנבגים הבלתי-מיניים,
המופיעים בזני הפטריות eas ו- rodA- הם כהים, בעלי מראה "רטוב", ולא מתפזרים היטב באויר. צילום במיקרוסקופ אלקטרוני סורק של נבג בעל rodlets (A, זן הבר) ושל נבג שחסר אותם (B, זן eas) מובא בתמונה 20. בעזרת אנזימי רסטריקציה מופתה המוטציה eas, ונמצאה כממוקמת קרוב מאוד לאתר ccg-2 . על בסיס העובדות הללו
שיערו לורוס ושותפיה (6), שהגן ccg-2 אללי ל- eas ומקודד להידרופובין, הדרוש ליצור ה- rodlets על פני הנבגים. השערה זו הוכחה בנסוי, שבו הוחדר הגן ccg-2 לתאים מזן eas. הטרנספורמציה גרמה להעלמות הפנוטיפ המוטנטי, והנבגים הציגו פנוטיפ נורמלי, כתום בהיר ונושא rodlets (תמונה C17). כמו כן, אינאקטיבציה של הגן
ccg-2 גורמת לפנוטיפ דמוי eas, ותאים מהזן eas מבטאים רמות מזעריות של ccg-2 mRNA (6).
גן נוסף, שמבוקר על-ידי השעון הביולוגי בנוירוספורה קראסה, הינו albino-3 (al-3), שמקודד לאנזים ג'רנילג'רניל פירופוספאט סינטאז (GGPPS), הדרוש לביוסינתיזה של קרוטנואידים. חשיפה לאור כחול משרה סינתיזת קרוטנואידים בנוירוספורה קראסה. הגן al-3 מכיל שתי יחידות שיעתוק חופפות בחלקן, ומשועתק לשני סוגי mRNA:
al-3(c) בן 2.2kb ו- al-3(m) בן 1.6kb. al-3(m) מתבטא באופן חולף בתאים בעקבות חשיפה לאור; ואילו al-3(c) מתבטא רק בזמן קונידיאציה, אך בזמן זה התבטאותו מוגברת בהשראת אור (2). כלומר גם הגן al-3 , כמו ccg-1, נתון מצד אחד לבקרה על-ידי השעון המחזורי, ומצד שני לבקרה על-ידי אור, שאינה תלויה בשעון. בפרומוטר
של al-3 זוהה אלמנט רגיש לאור, הנמצא גם בפרומוטר של ccg-2 (2).
4. דיון
בשנת 1992 הציעו לראשונה הרדין ושותפיו מודל לשעון הביולוגי, שבו התוצר החלבוני של משתנה המצב של השעון מבקר את יצורו שלו. מחקרם נערך על הגן per (period), שהינו משתנה מצב בשעון הביולוגי של זבוב הפירות דרוזופילה. לפי המודל לשעון שהם הציעו, השיעתוק המחזורי של הגן per מוביל למיקצב מחזורי ביצור תוצרו
החלבוני PER, כאשר החלבון PER מפעיל משוב שלילי על הגן per, הגורם לשיעתוקו במיקצב המחזורי. כך מרכיב אחד במערכת מבקר את השני בלולאת משוב שלילי הדדית בעלת תקופה מחזורית קבועה (8). דונלאפ ושותפיו (4) דיווחו על דוגמא שניה לסוג זה של בקרה עצמית ב"גן של שעון", במקרה זה הגן (frequence) frq בפטריה
נוירוספורה-קראסה, שמשפיע על המיקצב המחזורי של יצירת נבגים אסקסואליים על-ידי הפטריה. הם הסיקו, שתוצר הגן frq הינו משתנה מצב של השעון הביולוגי בפטריה נוירוספורה-קראסה. רמת הפעילות של FRQ וכן הקצב והכוון של שינוי פעילותו מגדירים למעשה את הזמן המחזורי, והם חלק מרכזי ממנגנון השעון ולא תוצרים המשקפים את
פעילות השעון.
חשיפה לגרויי אור קצרים מעל לסף שטף מסוים, בכל זמן לאורך מחזור התא, גורמת לעליה פתאומית בכמות ה- frq mRNA, עם קינטיקת תגובה דומה לזו של איתחול השעון (7). תופעה זו מחזקת את נכונותו של מודל הטעינה הבלתי פרמטרית של Pittenrigh, המניח שהארוע המוקדם ביותר הספציפי לשעון בתהליך האיתחול בהשראת אור הינו שינוי
מהיר וניכר ברמת הפעילות של משתנה המצב של השעון. דונלאפ ושותפיו (7) הציעו מודל, המסביר את הקשר בין העליה ברמת frq mRNA בהשראת גרוי אור קצר לבין כוון השינוי במיקצב (זרוז או השהיה) בזמנים מחזוריים שונים (המודלים מתוארים בפרק 2). כמו כן הם הציעו, שבשעות היום המוארות מתרחשת עליה ממושכת ברמות frq mRNA,
למרות נוכחותם של רכוזים גבוהים של FRQ, ואילו בזמן השקיעה והמעבר מאור לחושך התבטאות הגן frq פוחתת. פאזת השעון מוגדרת לפי רמות ה- frq mRNA וה- FRQ בתא, ולכן שינוי חד ברמות אלה גורם להסטת פאזה (shift) ולכוונון מחדש של השעון (reset).
מספר שאלות בולטות בקשר לשעון הביולוגי בנוירוספורה-קראסה נותרו עדיין חסרות מענה, והחשובה שבהן היא: מה טבעו של החלבון FRQ? למרות שמודל, המבוסס על בקרה עצמית של הגן frq על-ידי תוצרו, מתאים לכל הנתונים המדווחים, הוא יקבל תוקף סופי רק לאחר זהוי התוצר FRQ וחקר תכונותיו. כמו כן עדיין לא ברור הקשר בין
מוטציות, הגורמות לביטול כל פעילות של FRQ (מוטציות סתמיות - frq9 , frq10), לבין הפגיעה בכושר הפיצוי כנגד שינויי טמפרטורה (temperature compensation). בעוד שהמיקצבים בזן הבר אינם מושפעים באופן משמעותי משינויים בטמפרטורה, הרי שבזנים הסתמיים תקופת המחזור משתנה בערך פי- 2 כלפי שינוי של כל 10°C בטמפרטורה,
כפי שמתרחש בתהליכים ביוכימיים אחרים (8). זנים אלה היו בעלי מיקצביות דלה בחשיכה ממושכת, אולם יש נסיבות שבהן הם יכולים להפגין מיקצב (8). אם זנים מוטאנטים אלה לא מבטאים את FRQ, כיצד ניתן להסביר את הקיצביות הדלה שנותרה בהם? סביר להניח שקיימים משתני מצב נוספים ל- FRQ. אילו מאקרומולקולות נוספות דרושות
ליצירת המיקצב המחזורי? האם כושר הפיצוי כנגד תנאים סביבתיים משתנים נובע מהסטת מתג בין משתני מצב שונים של השעון הביולוגי, כך שבסך-הכל המצב היציב נשמר?
FRQ משפיע, ישירות או בעקיפין, על רמת התבטאותם של גנים שונים, הנתונים לבקרת השעון. דוגמאות לגנים כאלה כוללות את הגנים הספציפים לבוקר ccg -1 ו- ccg -2 (9), ואולי גם את al-3 (2) וגנים נוספים. הגן ccg -2, המבוקר על-ידי השעון, מקודד למרכיב בנבגים הבלתי מיניים, שחשוב להתפתחותם וליכולתם להתפזר באויר.
לירידה הדרמאטית בהתבטאות ccg -2בזן הפטריה eas אין השפעה על התפקוד הנורמלי של השעון המחזורי (6), דבר המחזק את הדיעה, שבשעון הביולוגי לא קיים משוב של מסלולי הפלט על המתנד. התבטאותם של ccg -1 ו- ccg -2 נתונה לבקרת השעון המחזורי, אולם ניתנת גם להשראה ישירה על-ידי אור, ללא תלות בהשפעותיו של האור על
משתנה המצב של השעון (1, 3). ניתן להסיק, שהאור מפעיל את הפרומוטר הן באופן ישיר (אלמנט רגיש לאור זוהה בפרומוטורים של גנים מבוקרי שעון שונים) והן בעקיפין, על-ידי שינוי פאזת השעון. עדיין לא ידוע כיצד מבקר משתנה המצב FRQ את התבנית המחזורית של התבטאות הגנים מבוקרי השעון, היוצרים את הפנוטיפ המקצבי.
החלבונים PER בדרוזופילה ו- FRQ בנוירוספורה-קראסה הם בעלי דמיון תפקודי מרשים, למרות העדר כל דמיון מבני. שניהם מפעילים משוב שלילי על שיעתוק הגנים המקודדים להם, אולם הם אינם מכילים אתרים קושרי DNA ידועים, כך שויסות השיעתוק מתרחש כנראה בתיווך יסודות נוספים. אתר גנטי, שאולי מקודד ליסוד כזה בדרוזופילה,
הינו הגן (timeless) tim. tim הוא הגן, שפגיעה בהתבטאותו גורמת להעלמות המקצבים המחזוריים בזן הדרוזופילה tim- . בזן זה נעלם גם המיקצב המחזורי של התבטאות per. בזבובים מזן הבר צביעה היסטוכימית של PER מדגימה נוכחות שלו, תוך שינוי מקצבי יומי, בגרעיני התאים בעין ובמוח. בנגוד לכך, בזן tim- לא נצפתה צביעה
בגרעינים. גם כאשר החדירו לזבובים חלבון מאוחה של PER ו- ?-גלקטוזידאז, החלבון חדר לגרעיני התאים בזבובים מזן הבר, אך לא בזבובים מזן tim- . חדירה של PER לגרעין הכרחית לבקרה העצמית שלו על התבטאות per, וככל הנראה חלבון המקודד על-ידי tim מסייע לטרנספורט זה (8, 10). יתכן שגם בנוירוספורה-קראסה קיים חלבון
דומה, המסייע ל- FRQ לחדור לגרעין, ואולי גם מתווך בין PER לעיכוב השיעתוק של הגן המקודד לו. האם גם החלבון הנוסף הזה מתבטא במקצב מחזורי? מנגנון כזה יכול להסביר את התקופתיות בשיעתוק frq. אם זה כך, מנגנון השעון מורכב אולי מרשת של לולאות משוב ולא מלולאת משוב יחידה. במקרה כזה, האם ניתן להפריד בבירור את
מנגנון השעון מפעולות תאיות אחרות?
יסוד נוסף שמגיב עם החלבון PER בזבובי הדרוזופילה הוא פרוטאין-קינאז (או אולי מספר פרוטאין-קינאזות). לחלבון PER יש אתרי זרחון רבים, והזרחון משתנה באופן מקצבי לאורך מחזור השעון. שינויים שלאחר התרגום יכולים לתרום להווצרות המקצב ברמת משתנה המצב בתא. למשל, זרחון יכול להפוך את החלבון רגיש יותר לפרוטאוליזה.
יתכן גם שזרחון החלבון מאפשר את העברתו לגרעין התא, או את תגובתו עם גורמי שיעתוק (פקטורי טרנסקריפציה).
החלבון PER מבוטא ברקמות רבות בזבובי הדרוזופילה, גם בכאלה שאינן ידועות כמעורבות בשעון המחזורי. בחלק מהרקמות הללו PER אף אינו נכנס לגרעיני התאים. ממצאים אלה מעידים, של- PER יש בוודאי תפקידים נוספים, שאינם קשורים לשעון המחזורי. דבר זה יכול להיות נכון גם לגבי frq בנוירוספורה-קראסה (10).
מודל תאורטי למערכות מחזוריות, המבוסס על הניסויים שהוצגו בעבודה זו בצרוף תוצאות נוספות, הוצע על-ידי דונלאפ ושותפיו (7). המתנד העיקרי במודל זה הינו לולאת המשוב, שבה הגן frq מקודד לחלבון FRQ, שבעצמו מדכא (בתיווך חומרי ביניים) את שיעתוקו של frq. המשוב השלילי, המופעל על frq באמצעות FRQ , מתווך כנראה
על-ידי גורמי שיעתוק אחרים (trans-acting factors), הפועלים על הפרומוטר. יתכן גם שהמשוב השלילי מופעל גם ברמה שלאחר השיעתוק. שינויים ביכולתו של FRQ לחדור לגרעין או מודיפיקציות שלאחר התרגום יכולים להשתתף בבקרת המשוב השלילי. הגורמים המתווכים העברה של מידע הזמן מהמתנד לגנים, שהתבטאותם מבוקרת על-ידי השעון
(כמו ccg-1, ccg-2), אינם ידועים. חשיפה לאור גורמת לאיתחול מהיר של פאזת השעון, באמצעות שינוי חד ברמת FRQ. המהירות והמשרעת של תגובת השעון לאור רומזת, שהאור פועל ישירות על הפרומוטר של frq וגורם לעליה בשיעתוקו, אם כי אין לשלול השפעת אור על frq mRNA, על הרמה והמיקום בתא של FRQ, או על מרכיבי שעון נוספים.
מן הראוי לציין, שלאחרונה (בשנת 1994) דווח גם על פיתוח עכבר הנושא מוטציה בשעון המחזורי. מוטציה זו האריכה את תקופת המחזור מ- 23 שעות בזמן הבר לכמעט 25 שעות במוטאנטים ההומוזיגוטים, ופגעה גם ביציבות המקצב המחזורי - ההומוזיגוטים איבדו את המיקצב המחזורי באור דמדומים קבוע. אתר המוטציה נקרא בשם clock ומופה
לכרומוזום 5 בעכבר, באזור שנמצא בכרומוזום 4 באדם (10).
מקורות
Arapia, G., Loros, J. J., Dunlap, J. C., Morelli, G. and Macino, G. The interplay of light and the circadian clock: Independent dual regulation of clock-controlled gene ccg-2(eas). Plant Physiol., 102: 1299-1305 (1993).
Arapia, G., Carattoli, A. and Macino, G. Light and development regulate the expression of the Albino-3 gene in Neurospora crassa. Developmental Biology, 170: 626-635 (1995).
Arapia, G., Loros, J. J., Dunlap, J. C., Morelli, G. and Macino, G. Light induction of the clock-controlled gene ccg-1 is not transduced through the circadian clock in Neurospora crassa. Mol. Gen. Genet., 247: 157-163 (1995).
Aronson, B. D., Johnson, K. A., Loros, J. J. and Dunlap, J. C. Negative feedback defining a circadian clock: Autoregulation of the clock gene frequency. Science, 263: 1578-1584 (1994).
Aronson, B. D., Johnson, K. A. and Dunlap, J. C. Circadian clock locus frequency: Protein encoded by a single open reading frame defines period length and temperature compensation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 7683-7687 (1994).
Bell-Pedersen, D., Dunlap, J. C. and Loros, J. J. The Neurospora circadian clock-controlled gene, ccg-2, is allelic to eas and encodes a fungal hydrophobin required for formation of the conidial rodlet layer. Genes Development, 6: 2382-2394 (1992).
Crosthwaite, S. K., Loros, J. J. and Dunlap, J. C. Light-induced resetting of a circadian clock is mediated by a rapid increase in frequency transcript. Cell, 81: 1003-1012 (1995).
Hastings, M. What makes the clock tick? Current Biology, 4(8): 720-723 (1994).
Loros, J. J., Denome, S. A. and Dunlap, J. C. Molecular cloning of genes under control of the circadian clock in Neurospora. Science, 243: 385-388 (1989).
Page, T. L. Time is the essence: Molecular analysis of the biological clock. Science, 263: 1570-1572 (1994).

תגים:

רפואה

אפשרויות משלוח:

ניתן לקבל ולהזמין עבודה זו באופן מיידי במאגר העבודות של יובנק. כל עבודה אקדמית בנושא "השעון הביולוגי בפטריה נוירוספורה קראסה", סמינריון אודות "השעון הביולוגי בפטריה נוירוספורה קראסה" או עבודת מחקר בנושא ניתנת להזמנה ולהורדה אוטומטית לאחר ביצוע התשלום.

אפשרויות תשלום:

ניתן לשלם עבור כל העבודות האקדמיות, סמינריונים, ועבודות המחקר בעזרת כרטיסי ויזה ומאסטרקרד 24 שעות ביממה.